[发明专利]一种快速检测食品添加剂(日落黄、胭脂红)联合毒性方法

摘要

本发明公开一种快速检测食品添加剂(日落黄、胭脂红)联合毒性方法。该方法针对食品添加剂日落黄、胭脂红的化合结构及其对细胞毒性作用的实验结果，筛选表征日落黄、胭脂红联合细胞毒性的特异性指标：细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH，通过高内涵分析系统对六个指标检测分析，根据特异性指标的分析结果鉴定其联合毒性。本发明方法对检测过程进行了优化，具有快速、可靠、重复性好、特异性强等优点，可以为食品添加剂日落黄、胭脂红的正确使用提供理论依据，对保证食品添加剂的正确使用和食品安全具有重要意义。

主权项

一种快速检测食品添加剂(日落黄、胭脂红)联合毒性方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1).在预铺细胞粘附剂的96孔板上，SMMC‑7721细胞以5×10⁴个/孔/100μL种板，37℃，5％ CO₂培养12h；步骤(2).取出步骤(1)携有培养后SMMC‑7721细胞的96孔板，弃掉培养液，然后加入160μL/孔RPMI‑1640培养基、40μL/孔5×待测样品，培养时间为72h；同时设立加入40μL/孔的细胞培养液作阴性对照；所述的待测样品为日落黄、胭脂红混合液，最终浓度依照食品包装袋上的剂量添加；步骤(3).取出步骤(2)培养后的96孔板，加50μL/孔的活细胞染料溶液，37℃孵育30min；所述的活细胞染料溶液为Hoechst 34580，Mitotracker orange，lysoTracker Deep Red三种染料的混合液，三者的最终浓度比值为1∶2∶1；步骤(4).弃掉培养液，加100μL/孔预温至37℃的固定液，常温避光放置20min；步骤(5).在步骤(4)处理后的96孔板中加入100μL/孔的PBS进行洗涤1次，再加入100μL/孔的透膜缓冲液，常温避光孵育10min；步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入100μL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入1000倍体积FITC标记的细胞微管蛋白抗体，常温避光孵育1h；步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入100μL/孔的PBS进行洗涤2次后，加入200μL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测，检测条件如下：第一通道选择“DAPI”检测Hoechst34580标记的细胞核，第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白，第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞)，第四通道选择“Fura‑2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值；普通光源下检测细胞总数；选择20倍物镜，每孔采集10个视野的图像，存储信息用于图像分析；步骤(8).采用MetaXpress分析软件对步骤(7)检测到的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析，并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示，根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂日落黄、胭脂红的联合毒性。