[发明专利]一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT‑PCR检测方法，属于PEDV病毒的快速检测技术领域。本发明为了克服病毒分离鉴定、基因测序繁琐、成本高、耗时长的缺点，也为了解决传统RT‑PCR特异性低、灵敏性差的问题；本发明提供了一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT‑PCR检测方法，该方法操作简便，使用简单，准确率高，特异性强，灵敏度高，既能检测发病动物机体感染PEDV是否为变异毒株，更能定性检测病料中PEDV的存在与否，极大地方便了生产中对PEDV区分是否为变异毒株的检测技术，更丰富了实验室对PEDV研究的内容。

主权项

一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT‑PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)合成目的片段：根据变异毒株的碱基插入原理，通过GenBank中PEDV的S基因序列，利用DNA Star软件进行同源性分析后，完全自主设计TGEV荧光定量PCR检测方法的引物；应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物，外引物上游PEDV/F‑1的序列如SEQ ID NO：1所示；外引物下游PEDV/F‑2的序列如SEQ ID NO：2所示；内引物上游PEDV/R‑1的序列如SEQ ID NO：3所示；内引物下游PEDV/R‑2的序列如SEQ ID NO：4所示；(2)套式RT‑PCR扩增反应：将PEDV毒株用Trizol法提取总RNA后进行反转录反应：2μL的RNA、1μL的PEDV/F‑2下游引物和3μL的ddH₂O混匀，70℃反应10min，然后冰上急冷两分钟；此反应混合溶液再加入2μL 5×MLV buffer，0.5μL dNTP Mixture，0.25μL RNase Inhibitor，0.25μL M‑MLV以及1μL ddH₂O；经42℃保温1h后，70℃保温15min，冰上冷却反应终止得cDNA；取2μL cDNA作为模板进行第一次PCR扩增：反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，外引物上游PEDV/F‑1和外引物下游PEDV/F‑2各1μL，r‑Taq酶0.5μL，ddH₂O 16μL并混合均匀；按照下列条件进行扩增：94℃预变性5min；95℃变性30s，49℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min终止反应；(3)第二次套式RT‑PCR扩增反应：取2μL第一次PCR产物作为模板，进行第二次PCR扩增，配置25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，内引物上游PEDV/R‑1和内引物下游PEDV/R‑2各1μL，r‑Taq酶0.5μL，ddH₂O16μL混合均匀；按照下列条件进行扩增：94℃预变性5min；95℃变性30s，51℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min终止反应；实现区分PEDV变异株和经典株的套式RT‑PCR检测。