[发明专利]一种人原代气道上皮细胞培养方法

摘要

本发明提供一种人原代气道上皮细胞的培养方法，通过清除气道脂肪及纤维组织，切成小块贴在预铺有IV胎盘胶原的24孔培养板中，加入150μl BMGM培养基，待上皮细胞从组织块边缘爬出，密度达70％时将组织块移至新的预铺IV胶原的孔内继续培养，重复5‑8次，至细胞增殖80‑90％丰度时，用胰酶‑EDTA消化；采用差异贴壁法去除成纤维细胞后，加入BEGM培养基重悬上皮细胞，接种于新的预铺IV胎盘胶原的培养皿中，传代比例不大于1:3，每3天换液1次，即完成细胞培养。本发明培养方法设计合理，结果稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好，且具有典型的气道上皮细胞细胞的形态及特点。

主权项

一种人原代气道上皮细胞培养方法，其特征在于：通过以下步骤实现：(1)收集带有气道的肺组织样品，将组织样品储存在预冷的含有双抗的无菌PBS溶液中；(2)在24孔细胞培养板内预铺IV型胎盘胶原醋酸溶液，置于超净台内过夜风干备用；(3)将步骤(1)组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在显微镜下分离出直径约1cm的气道，用预冷的含有双抗的无菌PBS溶液冲洗后，切块贴于步骤(2)制备的培养板中；(4)每个培养孔加入150μl的BEGM培养基，置入培养箱培养；(5)待上皮细胞从组织块边缘爬出，密度达70％时将组织块移至新的预铺IV胶原的孔内继续培养，由此获得原代气道上皮细胞；(6)当原代气道上皮细胞扩增至80‑90％丰度时，加入0.3‑0.5ml 0.1％‑0.2％胰蛋白酶溶液37℃消化1‑2分钟，加入1ml DMEM完全培养基终止消化并离心，采用差异贴壁法纯化上皮细胞后，用BEGM培养基重悬细胞，接种于预铺IV胎盘胶原的培养皿中，每3天换液1次，即完成传代细胞培养，获得传代培养的人气道上皮细胞。