[发明专利]一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法

摘要

本发明公开了一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法，所述筛选方法包括步骤：功能基因筛选及ORF分析、功能基因sgRNA识别位点引导序列预测、全基因组脱靶位点检测、依据脱靶信息与靶位点位置对预测的靶位点打分，排序、结果筛选与统计、算法优化与软件开发。本发明的猪的特异性sgRNA识别位点引导序列经过了严格的筛选与检验，包含所有猪蛋白编码基因的用于CRISPR‑Cas9基因编辑的sgRNA识别位点引导序列；本发明中对特异性sgRNA识别的鉴定、打分和检验算法，以及算法对应的用于预测和评估猪的功能基因sgRNA识别位点引导序列的软件可广泛用于具有全基因组序列的非模式物种的sgRNA特异位点预测。

主权项

一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)筛选猪全基因组序列中注释的蛋白编码基因中的外显子序列，标注可变剪接基因不同剪接模式间外显子的重叠状态用于5)中的搜索；2)利用脚本对步骤1)中从所有蛋白编码基因中获取的所有外显子序列，选取具有5’‑GN₂₀GG‑3’序列特性的位点，移除跨越外显子区域的序列，将剩余序列作为后续筛选特异性sgRNA识别位点引导序列的数据基础；3)将筛选到的所有候选sgRNA识别位点引导序列比对到猪全基因组序列上，通过序列同源性分析，首先移除在原始位点外具有其与其它基因组位置完整匹配的候选sgRNA识别位点引导序列，找出所有错配碱基数在5个以下的脱靶位点，并确定这些脱靶位点位于功能基因外显子或内含子内，或者基因间区部；4)构建打分矩阵，对所有候选sgRNA识别位点引导序列进行打分；5)统计sgRNA识别位点引导序列得分，选取每个蛋白编码基因中得分最高的3条sgRNA识别位点引导序列；当满足总得分的最大分值限制的sgRNA识别位点引导序列不足3条时，改变5’‑GN_XGG‑3'的结构式中的X值，由20逐步递减到16，重复步骤3)‑5)，直至获得符合条件的sgRNA识别位点引导序列；对于具有可变剪辑的基因，优先搜索不同剪接模式中重叠区域内的sgRNA识别位点引导序列，如数量不足，则使用非重叠区域来填补，以便每一种剪接形式的转录本都能覆盖。