[发明专利]一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA 的分析方法

摘要

本发明公开了一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA的分析方法，本方法首先从如皋黄鸡的新鲜受精蛋的胚盘、第19期(72h)的生殖脊和第18天的睾丸，分离出鸡ESCs、PGCs和SSCs,并根据CDH1基因设计特异性，以PCR扩增的方法进行性别鉴定，对运用抗体标记的ESCs、PGCs和SSCs进行分选,阳性细胞提取细胞总RNA，纯化后对RNA质量进行检测，检测合格后进行RNA‑Seq测序。将测序结果中筛选出组装RNA的转录本。分离鸡ESCs，PGCs和SSCs，提取总RNA，反转录为cDNA。对候选的lncRNA进行Trans和Cis靶基因的预测分析，并通过DAVID数据库查找其GO功能项，再通过GO分析注释其功能，对其进行功能分析。绘制关键lncRNA及其靶基因与相关信号通路之间的关系互作网络图。

主权项

一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分别从如皋黄鸡的新鲜受精蛋的胚盘、第19期的生殖脊和第18天的睾丸，分离出鸡ESCs、PGCs和SSCs；(2)对分离的ESCs和PGCs进行了性别鉴定，根据位于性染色体上的CDH1基因序列设计引物，通过PCR方法进行扩增，雄性为一条带，雌性为两条带；(3)以流式细胞分选技术，对运用抗体标记的ESCs、PGCs和SSCs进行分选，确保获得高纯度的细胞；其中选择SSEA‑1、SOX2干细胞表面特异抗原及分子标记物标记ESC，酪氨酸激酶受体C‑kit及SSEA‑1标记PGC，精原干细胞重要表面标志integrinα6及integrinβ1双重标记SSC；(4)提取流失分选的阳性细胞总RNA，纯化后使用Agilent 2100Bioanalyzer对RNA质量进行检测，检测合格后进行后续试验。参照Illumina公司mRNA‑Seq步骤进行RNA建库，使用Illumina公司HisSeq2000进行测序，上样量为50ng；测序结果同数据库进行比对注释后，进行后续实验分析；RNA标准为RIN≥7，28S/18S＞0.7；(5)结合Tophat和Cufflink程序包，将测序结果中筛选出组装RNA的转录本；(6)筛选出候选lncRNA后，分离鸡ESC，PGC和SSC细胞，提取总RNA，反转录为cDNA，以qRT‑PCR检测候选lncRNA的在ESCs、PGCs和SSCs中的表达变化，并与RNA‑Seq结果对比；(7)对候选的lncRNA进行Trans和Cis靶基因的预测分析，并通过DAVID数据库查找其GO功能项，再通过GO分析注释其功能，对其进行功能分析。同时以STRING对预测的靶基因进行蛋白网络互作分析,并绘制关键lncRNA及其靶基因与相关信号通路之间的关系互作网络图。