[发明专利]一种新的TGF-β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法

摘要

本发明公开了一种新的TGF‑β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA‑seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109762，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF‑β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109762+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6⁺interginβ1⁺细胞数量；采用鸡胚注射方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：Y2109762，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6⁺interginβ1⁺细胞数量。

主权项

一种新的TGF‑β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)基于RNA‑seq数据对TGF‑β信号通路富集；取新鲜受精蛋，依次用新洁尔灭、75％酒精洗蛋表面，用镊子将蛋钝头敲碎，药勺法无菌取出胚盘，将胚盘放入PBS中漂洗3遍获取ESC细胞；取孵化至4.5d的受精蛋，用新洁尔灭、75％酒精洗蛋表面；无菌获鸡胚，PBS中漂洗3次，体视显微镜下剥取生殖脊，利用胰酶进行消化，消化液用400目滤布过滤入离心管中，1 000×g离心6min，因子培养基悬浮，获取PGC细胞；取孵化至18d的受精蛋，用新洁尔灭、75％酒精洗蛋表面；无菌获取睾丸，PBS中漂洗3次，通过胶原酶、胰酶两步消化法对睾丸进行消化，消化液用400目滤布过滤入离心管中，1 000×g离心8min，因子培养基悬浮，获取SSC细胞；并分别提取ESC、PGC和SSC的RNA，构建测序文库并用Illumina HiSeqTM2000进行测序；对测序后的差异基因进行pathway富集并对TGF‑β信号通路进行筛选；(2)TGF‑β信号通路初步分析；对TGF‑β信号信号通路上差异基因在ESC,PGC和SSC中的表达变化进行分析，初步确定该信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程调控作用以及该信号通路信号传递机制；(3)体外验证TGF‑β信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的功能取正常发育的鸡胚，分组情况如下：对照组：正常ESCs，添加普通培养基；实验组：①BMP4；②BMP4+LY2109762；③BMP4+LDN193189；④BMP4+LY2109762+LDN193189；细胞在诱导培养过程中每个1天取样一次同时进行如下实验：a.形态观察及鉴定：采用倒置显微镜，比较实验组与对照组细胞的分化情况的差异，间接免疫荧光对诱导后的细胞进行表面蛋白检测；b.基因检测：各组细胞处理0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d后，收集细胞，QRT‑PCR检测生殖细胞的表达情况和TGF‑β信号通路受体基因的表达情况；c.蛋白检测：各组细胞处理0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d后，收集细胞，western检测生殖标记蛋白的表达情况和TGF‑β信号通路受体蛋白的表达情况；d.流式细胞分析：收集将各组诱导后的细胞，流式细胞法统计细胞的分化效率；(4)TGFβ信号通路调控ESCs向雄性生殖细胞分化功能的体内验证；取正常发育的鸡胚，分组情况如下，空白组：正常鸡胚，不经任何处理，直接孵化；对照组：通过开窗将胚盘暴露，注射等量ddH2O，再将窗口封闭，进行孵化；实验组：将候选信号通路抑制剂注射到胚盘中，再将窗口封闭，进行孵化；①LY2109762；②LDN193189；③LY2109762+LDN193189；鸡胚孵化过程中于0h，132h以及18d取样并进行如下实验；a.免疫组织化学：同时分别收集鸡胚发育过程中0h、72h、132h、以及18d的睾丸样本，通过组织切片法结合免疫组织化学法统计鸡胚发育至0h、132h PGCs的数量及形态变化，以及18d SSCs的数量及形态变化，并与正常发育条件下进行比较；b.基因检测：对上述收集的样本通过QRT‑PCR检测生殖标记基因表达情况和TGF‑β信号通路受体基因的表达情况；c.蛋白表达：对上述收集的样本通过western检测生殖标记蛋白表达情况和和TGF‑β信号通路受体蛋白的表达情况。