[发明专利]一种蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开一种蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法。该方法的步骤如下：选择蛋鸭，颈静脉放血处死，分别用新洁尔灭稀释液和酒精两次身体消毒，分离卵巢中3～8mm卵泡；剥离卵泡外层血管和结缔组织，固定卵泡，排出卵黄，剥离颗粒细胞层，清洗后离心弃上清，加入酶解溶液消化、过筛，M199培养基清洗，离心弃上清；加入红细胞裂解液，离心弃上清；加入含有胎牛血清的M199培养基，悬浮颗粒细胞，调整悬浮液细胞密度，接种培养，得蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞。本发明的方法不仅适用于鸭的大黄卵泡中颗粒细胞的分离，还适用于小黄卵泡颗粒细胞的分离；且颗粒细胞纯度高、活力好、细胞功能稳定；同时具有操作简单、易重复、结果稳定等优点。

主权项

一种蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于包括如下步骤：(1)选择160～300日龄蛋鸭，保定后对其进行颈静脉放血处死；(2)将处死鸭浸泡在新洁尔灭稀释液中1～3min，洗净，用经高温高压灭菌的纱布拭干多余新洁尔灭，转移；(3)用75％酒精喷洒鸭后，立即转移到超净台中；(4)剪开皮肤层和肌肉层，分离卵巢组织；按不同大小卵泡进行分离，放置在预冷的磷酸盐缓冲溶液中；(5)分离单个卵泡后，测量卵泡直径后分级，分别转移到PBS中；(6)选择直径在3～8mm范围内的卵泡；(7)轻轻去除卵泡外层血管与结缔组织；(8)固定卵泡后，将卵泡剪开，迅速挤压卵泡，排出卵黄，得到卵泡膜；(9)转移卵泡膜放置预冷PBS中，将卵泡膜内侧朝上，分离颗粒细胞层；(10)将混有颗粒细胞层的液体转移，剪碎，收集；(11)离心，弃上清；(12)加入酶解溶液，吹打3～6次后转移到平底玻璃消化瓶中，振荡孵育；(13)加入胎牛血清终止消化，轻轻吹打10～20次；(14)转移含有颗粒细胞的消化液过不锈钢细胞网筛，并用M199培养基冲洗网筛；(15)收集过筛细胞液，离心；(16)弃上清，加入红细胞裂解液，室温静置，离心；(17)弃上清，加入无血清M199培养基清洗细胞1～2次，离心；(18)弃上清，加入含有胎牛血清的M199培养基，悬浮颗粒细胞，使得细胞密度在1×10⁶～1×10⁷个/mL，得到颗粒细胞悬液；(19)加入颗粒细胞悬液到细胞培养皿中，培养；(20)颗粒细胞培养24小时后，换新鲜含有胎牛血清的M199培养基，贴壁细胞为蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞。