[发明专利]牛源VCAM-1多克隆抗体的制备方法及应用

摘要

本发明属于一种牛源VCAM‑1多克隆抗体的制备方法及应用。该方法包括下列步骤：(1)、RNA提取；(2)、反转录PCR；(3)、引物；(4)、基因片段的扩增；(5)、基因的克隆；(6)、原核表达载体的构建；(7)、重组质粒在大肠杆菌中的表达及鉴定；(8)、重组蛋白质的纯化；(9)、蛋白印迹；(10)、重组蛋白的透析及浓度的测定；(11)、免疫抗原的制备；(12)、免疫及采血；(13)、血清的分离。本发明该多克隆抗体可用于识别牛重组VCAM‑1蛋白和天然牛源VCAM‑1蛋白,所述VCAM‑1多克隆抗体效价高，特异性强。特别是针对牛源天然VCAM‑1蛋白。

主权项

一种牛源VCAM‑1多克隆抗体的制备方法，包括下列步骤：(1)、RNA提取：按分子克隆实验法从健康奶牛中提取；(2)、反转录PCR；(3)、引物：通过比对该基因序列的酶切位点以及表达载体pET‑28a和pGEX‑4T‑1的酶切位点，确定酶切位点,上游引物的酶切位点为EcoRI，下游引物酶切位点为XhoI，引物的具体信息如下：上游引物V1 5′‑gaa ttc tcc caa atc gac ata ttc cc‑3′；下游引物V2 5′‑ctc gag TTA ttt ctc ttg aac agt taa tt‑3′，斜体部分为酶切位点序列，下划线部分为终止密码子，扩增的目的片段长度为879bp；(4)、基因片段的扩增：以提取的RNA经反转录得到的cDNA为模板，以V1和V2为引物进行PCR扩增，反应体系为25μL，目的片段扩增的参数为：94℃3min；94℃1min，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；(5)、基因的克隆：A、PCR产物回收：按DNA凝胶回收试剂盒回收产物PCR；B、目的基因与pMD18‑T克隆载体的连接：将回收的PCR产物与pMD18‑T载体进行连接，混匀离心后置16℃连接10h；C、转化；D、质粒的小量制备；E、重组质粒的鉴定：提取质粒后，用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，阳性克隆命名为DH5α‑pMD18‑VCAM‑1；(6)、原核表达载体的构建：A、重组克隆质粒和表达载体的酶切及目的片段的回收：将测序正确的DH5α‑pMD18‑VCAM‑1提取质粒，并应用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ对DH5α‑pMD18‑VCAM‑1，原核表达载体pET28a和pGEX‑4T‑1进双酶切，然后用DNA回收纯化试剂盒回收目的DNA片段；B、重组表达载体的构建：将从重组克隆载体粒DH5α‑pMD18‑VCAM‑1酶切下的目的片段分别与表达载体pET28a，pGEX‑4T‑1的DNA线性片段连接，混匀并离心后，置16℃水浴16h；取连接反应液转化BL21感受态细胞，转化；C、重组表达质粒的鉴定：用EcoR Ⅰ和Xho I双酶切鉴定、测序；阳性克隆命名为DH5α‑pMD18‑VCAM‑1；(7)、重组质粒在大肠杆菌中的表达及鉴定：A、重组蛋白的诱导表达：0.1mM/L IPTG进行诱导，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6，2～3h；B、表达产物的鉴定SDS‑PAGE：分别取诱导和未诱导的菌液12000rpm离心1min，弃上清，菌体沉淀做SDS‑PAGE分析；(8)、重组蛋白质的纯化：A、利用His GraviTrap亲和纯化His标签融合蛋白；B、利用Gluthathione‑Sepharose 4B亲和纯化GST标签融合蛋白；(9)、蛋白印迹：一抗为TBST 6000倍稀释鼠源抗His标签单抗，二抗为用TBST 20000倍稀释羊抗鼠IgG抗体，碱性磷酸酶标记，BCIP/NBT显色液显色；(10)、重组蛋白的透析及浓度的测定：应用BCA蛋白浓度测定试剂盒；(11)、免疫抗原的制备：将已知浓度的重组蛋白His‑VCAM‑1进行稀释与弗氏佐剂按体积比1：1混合，乳化器中充分乳化，以乳化液滴入水中不散开为好；(12)、免疫及采血：A、免疫及采血，0周免疫前采血，0周免疫，2周采血，3周免疫，5周采血，6周免疫，8周采血，10周采血；B、免疫方法：3只大鼠,苦味酸标记，3次后腿肌肉注射免疫，各组大鼠免疫剂量50μg蛋白/500μL/只，并设一只阴性对照大鼠，间隔3周，第一次免疫前、每次免疫后2周尾静脉采血100μL并在第四次采血后2周后进行第五次采血；(13)、血清的分离：所采集Wistar大鼠血在37℃下静置2h后置于4℃冰箱过夜，待血清析出后，1500g离心10min，小心吸出血清分装放于‑80℃保存。