[发明专利]从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法

摘要

本发明涉及血管细胞分离技术领域,特别涉及一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法：获取外周血样，用PBS磷酸缓冲液稀释；在羟乙基淀粉溶液中加入稀释的血液，离心,吸取中间白膜细胞层的单个核细胞液；用PBS磷酸缓冲液稀释，离心弃上清,剩余物用培养液重悬；培养传代。分离效率高，杂细胞少，仅需少量的实验器材；分离效果好，具有可重复性。

主权项

一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法,其特征在于包括以下步骤：（1）获取待分离富集的外周血样，在离心管中颠倒混匀一次，用pH 7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释得到稀释的血液，稀释时先向管中加入PBS磷酸缓冲液，再加入外周血样；（2）取4个50mL离心管，每个加质量/体积百分比浓度为3.5‑5.0 %的羟乙基淀粉溶液15mL，在羟乙基淀粉溶液中缓慢加入20mL稀释的血液，确保稀释的血液留在羟乙基淀粉溶液上层，室温375‑425r/min，离心30‑35min, 结束后吸取中间白膜细胞层的单个核细胞液，每两管的吸取物合并为一管；（3）取2个新管，每管加入15‑20mL步骤(2)中得到的吸取物，分别用pH 7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释，室温275‑325r/min，离心15‑20min,弃上清,剩余物用1mL培养液重悬, 培养液组成为每80mL EBM‑2基础培养基中加入FGF2 0.1‑0.2mL、VEGF 0.1‑0.2mL、IGF‑1 0.1‑0.2mL、BMP‑4 0.1‑0.2mL、LiF 0.3‑0.5 mL和GA 0.1‑0.2mL；（4）将8mL培养液加入其中一管，混匀后加入另一管，共10mL悬液；（5）计数；（6）胶原蛋白酶I铺细胞培养瓶： 50μg/mL的胶原蛋白酶I 105μL溶于0.02M的醋酸7.5mL，0.22μm过滤器过滤，铺于T75瓶，37℃1小时，室温1小时，10mLDPBS冲洗2次，加5mL培养液；将步骤（4）得到的10mL悬液注入，48h后半换液一次，操作为抽出7.5mL原培养液，新加入7.5mL培养液，此后每72h半换液一次，培养条件 CO₂培养箱中37℃、CO₂浓度5%；（7）传代：细胞增殖至细胞密度为90‑100%时，传至3个培养瓶。