[发明专利]硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法

摘要

本发明公开一种硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，包括：将蛋壳基质干燥后粉碎，获得蛋壳基质粉末；从蛋壳基质粉末中分离、提取总糖胺聚糖；去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及透明质酸，从而获得高纯度的硫酸软骨素/硫酸皮肤素。

主权项

一种硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，包括：S1，将蛋壳基质干燥后粉碎，获得蛋壳基质粉末；S2，将所述蛋壳基质粉末悬浮于磷酸盐缓冲液PBS中，其中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7～11，且含有0～0.6wt％的十二烷基磺酸钠，所述蛋壳基质粉末与磷酸盐缓冲液的质量比为1：10～80；S3，在步骤S2所获得的悬浮液中加入链霉蛋白酶～Actinase E，并保持反应温度为37～39℃，处理12～28小时以降解所述蛋壳基质粉末中的蛋白质；S4，将步骤S3中的链霉蛋白酶～Actinase E灭活；S5，将步骤S4中获得的产物用蛋白酶K或碱性蛋白酶～alcalase在53～56℃温度下处理6～24小时以进一步降解所述蛋壳基质粉末中残余的蛋白质以及灭活的链霉蛋白酶～Actinase E；S6，将步骤S5中的蛋白酶K或碱性蛋白酶～alcalase灭活；S7，将步骤S6所获得的产物离心分离，获取上清液；S8，从步骤S7获得的上清液中提取总糖胺聚糖；S9，将从步骤S8获得的总糖胺聚糖溶解于水或50mM Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)·HCl缓冲液，其中，所述缓冲液的pH为7～9；然后加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、角质素酶以及透明质酸酶于37℃反应12～24小时以降解总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及透明质酸；S10，从步骤S9获得的产物中加入强效阴离子交换柱，或加入强碱性阴离子交换树脂结合过夜，上清液与树脂体积比为5～80：1；之后用0.1～0.5M的NaCl洗涤所述强效阴离子交换柱或所述强碱性阴离子交换树脂以去除酶解后的糖链碎片或其它杂质，再用3.3M的NaCl洗脱获得硫酸软骨素/硫酸皮肤素盐溶液；随后，或者用截留量为3～10kDa的超滤管或透析袋脱盐获得硫酸软骨素/硫酸皮肤素；或者先用2～5倍体积的无水甲醇加入硫酸软骨素/硫酸皮肤素盐溶液，在‑20～8℃沉淀12～18小时，离心，弃含盐上清，之后用体积浓度70～95v％甲醇洗涤硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀；最后冻干或空干获得最终产物硫酸软骨素/硫酸皮肤素。