[发明专利]一种提高烟草中类黄酮含量并提升烟草抗旱性的方法及其检测方法

摘要

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种提高烟草中类黄酮含量并提升烟草抗旱性的方法，具体涉及在烟草K326中过表达查尔酮合成酶（CHS）基因，从而提高烟草中类黄酮含量并提升烟草抗旱性。检测结果表明过表达CHS基因烟草中的类黄酮含量（芦丁、槲皮素、山奈酚苷、紫云英苷、柚皮苷、柚皮素、异甘草素）明显高于对照烟草；干旱处理旺长期烟草14天，通过观察表型、测定相对含水率、测定MDA含量，测定H₂O₂含量等方法验证转基因烟草的耐旱性，结果表明过表达CHS基因烟草的耐旱性显著强于普通烟草。

主权项

1.一种提高烟草中类黄酮含量并提升烟草抗旱性的方法,其特征在于：采用PCR技术获得CHS基因，并构建过表达载体后，用农杆菌转化法转入烤烟类烟草叶片，具体步骤如下：（1）提取烤烟类烟草总RNA，反转录后获得cDNA，并以PCR技术从烟草cDNA中扩增出CHS基因编码序列；具体过程为：以如下核苷酸序列为引物：NtCHS‑F： 5’‑AGCCATTTGAAAACCCTAG‑3’，NtCHS‑R： 5’‑CAAATTTCATTATTTGCAAG‑3’，进行PCR扩增，扩增条件为94℃ 1 min；再进行 35个循环，每个循环94℃ 30 s, 50℃ 30 s ，72℃ 90s；68℃终延伸10 min；反应体系为50μL ：cDNA模板 2μL、上下游引物各2.5μL、 dNTPs 4μL、10×Buffer 5μL、高保真PCR酶0.5μL，ddH₂O 33.5μL；（2）将所获得CHS基因插入载体pH7WG2D中获得植物表达载体pH7WG2D‑NtCHS；具体过程为：通过gateway重组系统将步骤（1）所得基因CHS扩增产物克隆入过表达载体pH7WG2D中获得植物表达载体pH7WG2D‑NtCHS；（3）将所得植物表达载体转化到根瘤农杆菌EHA105中；（4）将所得农杆菌转化子侵染烤烟类烟草叶片，获得T₀代转基因植物；（5）培育T₀代转基因植物到种子成熟，并收获种子；（6）将收获的种子种植在温室中，得到类黄酮含量升高并提升抗旱性的转基因烟草。