[发明专利]一种用于检测HLA-DP基因rs3077位点多态性的质粒标准品及其制备方法

摘要

本发明提供了一种用于检测HLA‑DP基因rs3077位点多态性的质粒标准品，其制备方法包括以下步骤：(1)设计HLA‑DP基因rs3077位点的引物，正、反向引物序列分别为：5′‑AATAACTGTGTGTGTTGCTG‑3′和5′‑TCAATATCCTCAGACCTTTC‑3′；(2)筛选HLA‑DP基因rs3077位点CC基因型和TT基因型的EDTA抗凝外周血标本；(3)构建含HLA‑DP基因rs3077位点三种不同基因型目的片段的质粒标准品。该标准品具有纯度高、成本低、易于保存、准确度高、特异性和稳定性好、可减少实验误差等优点，可长期用于HLA‑DP基因rs3077位点多态性检测。

主权项

一种用于检测HLA‑DP基因rs3077位点多态性的质粒标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计引物：以HLA‑DP基因rs3077位点的基因序列为模版，用Primer‑BLAST设计引物，正、反向引物序列分别为：5′‑AATAACTGTGTGTGTTGCTG‑3′和5′‑TCAATATCCTCAGACCTTTC‑3′；(2)HLA‑DP基因rs3077位点CC基因型和TT基因型EDTA抗凝外周血标本的筛选：采集健康人EDTA抗凝外周血3mL，提取DNA，然后进行PCR扩增、测序，根据测序结果筛选HLA‑DP基因rs3077位点基因型分别为CC和TT的标本；(3)构建分别含HLA‑DP基因rs3077位点CC、CT和TT基因型的质粒标准品，具体步骤为：①DNA的提取和目的片段的扩增：提取已筛选出的基因型分别为CC和TT外周血标本的DNA，测定其浓度和纯度，然后以该DNA为模板，进行PCR扩增，获得含rs3077位点CC和TT基因型的目的片段，纯化后备用；②连接和转化：分别将纯化产物与pGM‑T Vector在16℃下过夜，连接，分别取10μL连接产物加入50μL DH5a感受态细胞中，冰中放置30min，然后42℃水浴90s，再在冰中放置2‑3min，再加入950μL不含Amp的LB液体培养基，37℃，200r/min，振荡培养1h，取100μL培养液涂布于含有Amp的LB琼脂固体培养基上，37℃下倒置培养14‑16h；③质粒的鉴定：挑取步骤②中得到的白色单菌落，将其接种于含Amp的LB液体培养基中，于37℃，200r/min，培养16‑20h后提取质粒，以该质粒为模板进行PCR扩增，测序鉴定。