[发明专利]一种基于核酸外切酶和核酸探针的电化学检测特定单链DNA浓度的方法

摘要

一种基于核酸外切酶和核酸探针的电化学检测特定单链DNA浓度的方法，属于分析化学技术领域。本发明设计合成了两种发夹型探针P1和P2。首先，用1,6‑己二硫醇HDT将金纳米颗粒修饰金电极，制备AuNPs‑HDT‑Au电极，然后将P1探针修饰到电极上。以特定单链目标DNA作待检测物，在没有目标DNA存在时，P1和P2探针能够共存；在目标DNA、P2探针和核酸外切酶Exo存在时，目标DNA能触发两个独立的反应循环。最后在血红素存在时，保留在电极表面的P1探针的G‑四链体序列和血红素相互作用，产生强烈的电信号，用差分脉冲伏安法对目标DNA进行检测，峰电流信号与目标DNA浓度之间在一定浓度范围内呈相关性，实现对目标DNA浓度的检测。本发明方法具有灵敏度高、特异性强的优点。

主权项

1.一种不用于疾病诊断和治疗的基于核酸外切酶和核酸探针的电化学检测特定单链DNA浓度的方法，其特征在于包括如下步骤：金纳米颗粒的制备；利用1,6‑己二硫醇HDT修饰金纳米颗粒，使P1能在电极表面的AuNPs上形成自组装单分子层修饰金电极；将发夹型P1探针固定到金纳米颗粒修饰的金电极上；将不同浓度的特定单链目标DNA、0.5 μM 的P2探针、50U的核酸外切酶Exo 和固定在电极表面的0.35 μM的P1探针混合杂交作用，包括：特定单链目标DNA和P1探针的区发生杂交反应形成P1‑目标DNA杂交双链，P2探针取代目标DNA序列和P1探针发生杂交反应形成P1‑P2杂交双链，目标DNA释放并再次进入杂交循环，Exo识别P1‑P2杂交双链并水解切割双链区的P1探针使得线性的P2探针释放出来再次进入循环；P1探针的区保留在电极表面，在血红素hemin存在时形成G‑四链体‑hemin复合物，电化学法检测响应电流值；P1探针由三部分组成：区含有形成G‑四链体结构的核酸序列，区是目标DNA的互补序列，区和区为互补序列；P2探针也由三部分组成：区能和P1探针的3’端序列互补，并能被区杂交封闭，区含有和目标DNA相同的碱基序列；目标DNA，其序列为：5’‑TGGAGCTGGTGGCGTAGGCA‑3’；P1探针序列为：5’‑HS‑(CH₂)₆‑GGGTGGGCGGGATGGGTTACGCCACCAGCTCCA ACCCATCCTT‑3’； GGGTGGGCGGGATGGGT为区，TACGCCACCAGCTCCA为区，ACCCATCCTT为区；P2探针序列为：5’‑AAGGATGGGTGGAGCTGGTGGCGTAGGCACTCCACCCATCCAGAC‑3’；AAGGATGGG为区，TGGAGCTGGTGGCGTAGGCA为区，CTCCACCCATCCAGAC为区。