[发明专利]一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种原代小鼠或大鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，开创性的引入了灌流的方法，灌流充分，无死角。制备的复合酶消化液，相比传统单一的胶原酶预热消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。此外，本发明中细胞接种贴壁12h内，用pH值为6‑6.5的细胞培养基，可以极大的提高细胞的贴壁率，贴壁效果更好。本发明的原代小鼠或大鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法获得细胞总量大，分离度高，活率高，而且细菌、真菌和其他细胞的污染概率低，同时还能够进行传代培养，本发明中大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞培养方法为基础的相关研究提供了良好的细胞培养方案。

主权项

一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法，包括以下步骤：步骤1：小鼠或大鼠胃组织的提取打开处死的小鼠或大鼠的腹腔，将胃组织分别在贲门部和幽门部断开，然后将取下的胃组织浸泡在PBS溶液里，放在冰上保存备用；步骤2：清洗和预灌流将步骤1中的胃组织使用D‑Hanks溶液清洗后，从贲门到幽门使用针头被砂纸磨平的头皮针向胃组织内灌注预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.6mM/L的EGTA，2％双抗和1％两性霉素；步骤3：冲洗灌流将步骤2处理后的小鼠或大鼠胃组织用冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌流液的配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/L Na₂HPO₄·12H₂O，3mM/L CaCl₂，2％双抗和1％两性霉素；步骤4：胃粘膜层的剥离将步骤3中处理得到的胃组织剖开，仔细去除胃内容物，在解剖显微镜下，用无菌镊子撕下胃黏膜上皮；步骤5：复合酶消化将步骤4中撕下的胃黏膜上皮剪碎后，放置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤6：分离培养胃粘膜上皮细胞步骤5中消化完毕的胃粘膜上皮细胞，用D‑Hanks溶液进行吹打洗脱，过70um筛网后，再离心洗涤，然后重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到胃粘膜上皮细胞，将其放置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。