[发明专利]一种表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种表达载体，包含至少一个调控单元，其含有增强子和启动子：增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体，或Act5C启动子或其功能片段或序列变体；其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强子，或AcMNPV中的hr3增强子；所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子诱导；所述的Act5C启动子为果蝇细胞中的Actin 5C启动子。所述表达载体可在果蝇S2细胞高效表达。本发明构建了一个能够在双翅目昆虫果蝇S2细胞上高效表达的含鳞翅目杆病毒基因hr5增强子的重组蛋白表达载体，克服了现有技术中由于种属隔离的原因，杆病毒不在双翅目昆虫中传播的技术偏见。

主权项

1.一种表达载体在果蝇S2细胞中的应用，其特征在于，以果蝇S2细胞作为宿主细胞，所述果蝇S2细胞中包含有所述表达载体；所述表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有增强子和启动子：其中，增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子，hr5增强子采用如SEQ NO ID.2第1‑482位所示序列；启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子或其功能片段，或果蝇细胞中的Actin 5C启动子或其功能片段；所述金属硫蛋白启动子为诱导性启动子，受金属离子诱导，所述金属硫蛋白启动子功能片段为SEQ NO ID.1第1‑422位所示序列；所述Actin 5C启动子功能片段为SEQ NO ID.3第3411‑3711位所示序列；所述hr5增强子与金属硫蛋白启动子或Actin 5C启动子连接；所述表达载体的构建方法包括如下步骤：当启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子或其功能片段时：1)使用特异性寡核苷酸引物在pMT/V5‑His的模板上扩增MT，扩增产物使用SapI和NotI消化并在质粒pIEx‑10亚克隆产生pMT；该特异性寡核苷酸引物为：5’‑AAG CTC TTC TTG CAG GAC AGG ATG TGG T‑3’；5’‑AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT‑3’；2)使用另一特异性寡核苷酸引物在pMT/V5‑His的模板上扩增MT并用NheI和NotI酶切在质粒pIEx‑10中亚克隆产生phrMT；质粒phrMT即为所要构建的表达载体，其中保留了hr5增强子和金属硫蛋白启动子；该另一特异性寡核苷酸引物如下：5’‑AAA GCT AGC TTG CAG GAC AGG ATG TGG TG‑3’；5’‑AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT‑3’；当启动子为果蝇细胞Actin 5C启动子或其功能片段时：1)在pUC‑Act的模板上采用如下引物进行扩增Act5C：5’‑AAG CTC TTC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT‑3’；5’‑AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC‑3’；扩增产物使用SapI和NotI消化并在质粒pIEx‑10中亚克隆产生pAct5C；2)在pUC‑Act的模板上采用如下引物扩增Act5C：5’‑AAA GCT AGC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT‑3’；5’‑AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC‑3’；扩增产物用NheI和NotI酶切在质粒pIEx‑10中亚克隆产生质粒phrAct5C，即为所要构建的表达载体，其中保留了hr5增强子和Actin5C启动子。