[发明专利]一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法，利用本发明所述方法可以对纯化的感光细胞前体细胞进行分析筛选，找到一种感光细胞所特异的表面蛋白，其特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜感光细胞膜表面；从而利用该特异性表面蛋白对诱导的人胚胎干细胞或人多能干细胞来源的感光细胞进行纯化。通过表面蛋白筛选获得的纯化感光细胞，可以避免转基因或者应用多种小分子化合物为诱导剂所带来的潜在危险。这一关键科学问题的解决，将加快干细胞向临床转化的过程，符合医学研究的需要，为人类视网膜相关疾病(如青光眼、黄斑性眼病等)的细胞替代治疗奠定了基础。

主权项

一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)利用Talen技术，建立Crx‑GFP的人胚胎干细胞系，将这种Crx‑GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，通过FACS筛选，将表达GFP的感光细胞前体细胞筛选并纯化；(2)应用BD公司的表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的感光细胞前体细胞进行筛选，确定一种感光细胞表面蛋白；(3)为了证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否仅仅表达在感光细胞上，将人胚胎干细胞诱导分化至第6周，利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选，分别获得表面蛋白阳性和特异性表面蛋白阴性的细胞；(4)证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性的表达在感光细胞膜表面；(5)确定筛选获得的感光细胞表面蛋白特异性的表达在感光细胞膜表面后，为了证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能，将步骤(3)中得到的细胞与色素细胞系ARPE‑19进行共培养，如果得到的细胞可以成熟，则得到的细胞与色素细胞系ARPE‑19共培养后，将会看到感光细胞的外节可以被色素细胞系所吞噬；在确定了得到的细胞可以形成外节并被色素细胞所吞噬之后，利用RCS小鼠的动物模型，将得到的细胞移植到小鼠眼球视网膜下腔；观察小鼠的视觉功能是否有部分改善。