[发明专利]一种用于桑树植原体基因组的纯化方法

摘要

一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，利用植原体具有细胞膜且其基因组为半自主复制的特点，采用DNA甲基化结合蛋白，从纯化的感染植原体的桑树全基因组中去除桑树基因组，通过半定量和定量PCR均证实所获的DNA纯度较高，浓度较大的桑树植原体基因组DNA，解决了木本植物植原体含量低，脉冲电泳纯化困难的问题，并利用定量PCR对本发明效果进行了验证，所获得的植原体基因组浓度和比例较高，可以用于PCR实验和高通量测序。

主权项

1.一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、样品处理，利用解剖刀取桑树感染植原体的病株的枝条的韧皮部1g，放入干净的研钵中，加入液氮冷冻后研磨均匀；步骤二、提取基因组DNA，采用1.5ml离心管收集步骤一粉末，并迅速加入500‑700ul缓冲液SLX和5‑10ul核糖核酸酶A，利用涡旋器混合均匀，于70摄氏度孵育10分钟后经14000转离心5分钟，仔细吸取上清液到一个干净的1.5ml离心管中，加入30‑50ul磁珠和300‑500ul无水乙醇，混合均匀，利用磁力架吸附磁珠，丢弃上清，并用70‑75%的乙醇洗涤,重复3次后，利用60‑100ul缓冲液TE洗脱，完成基因组DNA的提取；步骤三、利用甲基化结合蛋白去除桑树的基因组，首先在1.5ml的离心管中加入100‑200ul蛋白A磁珠，置于磁力架吸附5分钟后，去除上清，加入缓冲液C和无核酸酶的水，无核酸酶的水根据要求补充至所需总体积，所述的缓冲液C稀释比例为1:10，加入10‑20ul链霉亲和素标记的甲基化结合蛋白MBD2，22‑25摄氏度震荡孵育10‑15分钟，置于磁力架吸附5‑7分钟，去除上清，再加入10‑20ul缓冲液C、15‑30ul水和25‑50ul与步骤二提取的基因组DNA，25摄氏度震荡孵育20分钟，置于磁力架吸附5分钟，仔细吸取上清到一个新的1.5ml离心管中，加入2‑3倍体积的无水乙醇和10‑20ul5M氯化钠，冷冻2小时后4度14000转离心10分钟，沉淀用70‑75%的乙醇洗涤2次后用80‑100ul缓冲液TE溶解，电泳检测；步骤四、去除碎片DNA段，步骤三产物利用琼脂糖电泳，在1.5%的胶浓度，电压5V/CM，由细菌噬菌体Bacteriophageλc1857 Sam7 DNA用EcoT14I酶切反应后配制而成的λ‑EcoT14Ⅰdigest DNA Marker为指示，利用玻璃奶吸附的方法回收19329bp以上的DNA，用于下一步骤；步骤五、基因定量PCR所使用的引物，在2只200ul薄壁管中分别加入双蒸水，计算后补充总体至100ul、100微摩3端双硫代修饰的6随机引物25‑30ul、反应缓冲液10ul、步骤二和步骤四所得的产物分别10‑15ul，于95摄氏度加热3分钟，置于冰上20分钟，然后加入脱氧核糖核苷三磷酸dNTP，10mM，4‑5ul，2‑3ul的10mg/ml牛血清白蛋白BSA，phi29聚合酶4‑5ul，30摄氏度孵育12小时，65摄氏度10分钟灭活合成酶，处理后浓度为126ng/ul，可以满足测序或PCR要求，稀释至500ul分装冷冻保存备用；其中所用的引物为：所述的100微摩3端双硫代修饰的6随机引物为常用引物，硫代修饰为防止酶对引物的降解；步骤六、利用CFX Connect TM荧光定量系统，使用Power SYBR® Green PCR Master Mix进行定量PCR对步骤五所得样品中的植原体基因组和桑树基因组进行定量分析；所述的缓冲液SLX为1%的去氢胆酸钠Sodium deoxycholate，0.5%的亮抑蛋白酶肽Leupeptin，1%的聚乙二醇辛基苯基醚TritonX‑100混合溶液；所述的缓冲液C为25mM4‑羟乙基哌嗪乙磺酸，62.5mM氯化镁，5mMDTT，50%甘油，0.5M氯化钾的混合溶液；所述的反应缓冲液为0.5MTris，0.1M氯化镁，0.1M硫酸铵，0.1M二硫苏糖醇DTT的混合溶液；所述的缓冲液TE为10mM的Tris‑HCl缓冲液，1mMEDTA的混合溶液。