[发明专利]用于表达T4连接酶的家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其应用与方法有效
| 申请号： | 201610292120.2 | 申请日： | 2016-05-04 |
| 公开（公告）号： | CN105907784B | 公开（公告）日： | 2019-12-20 |
| 发明（设计）人： | 钟伯雄;张玉玉;叶露鹏 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;A01K67/04 |
| 代理公司： | 33200 杭州求是专利事务所有限公司 | 代理人： | 林超 |
| 地址： | 310027 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种用于表达T4连接酶的家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其应用与方法。质粒以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包含有作为外源基因的T4连接酶基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因的功能表达框，质粒用分子生物学方法构建，且DDDDK与丝素轻链基因polyA之间含有ApaI和NheI专一性的两个酶切位点，采用ApaI和NheI双酶切通用型质粒，与T4连接酶基因连接后，与辅助质粒共同注射到家蚕受精卵内，利用转座子特性使绿色荧光蛋白基因和T4连接酶基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，获得转基因家蚕。本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕丝腺细胞特异地合成分泌T4连接酶蛋白。 | ||
| 搜索关键词： | 用于 表达 t4 连接酶 家蚕 后部 生物反应器 启动子 通用型 质粒 及其 应用 方法 | ||
【主权项】：
1.一种用于表达T4连接酶的家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：所述的质粒为piggy-10004质粒，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个分别包含有作为外源基因的T4 连接酶基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因的功能表达框；/n一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3 Promoter -EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、18s rRNA启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、His 6序列、肠激酶酶切位点DDDDK、T4连接酶基因和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chainsignal peptide-His 6-DDDDK-T4 Ligase- Fibroin L chain PolyA；/n所述的piggy-10004质粒是利用双启动子Fibroin L chain Promoter和18s rRNApromoter驱动T4连接酶基因的表达。/n
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