[发明专利]分泌表达GLP-1的乳酸乳球菌的制备方法及其应用

摘要

一种分泌表达GLP‑1的乳酸乳球菌的制备方法及其应用，是通过化学合成人源胰高血糖素样肽 I，简称GLP‑1，即1‑37个氨基酸的有效功能区域，并加入乳酸乳球菌特有的分泌表达穿膜肽SPusp45,构建pMG36e‑GLP‑1重组质粒，电转进入乳酸乳球菌，实现GLP‑1的分泌表达，并通过饮食进入人体肠道后可以实现GLP‑1的持续表达，实现对II 型糖尿病病症的缓解和治疗作用。

主权项

一种分泌表达GLP‑1的乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：一、pMG36e‑GLP‑1重组质粒构建1、PstI‑SPusp45‑GLP‑1‑HindIII全序列化学合成获得pUC57‑GLP‑1重组质粒；2、构建pMG36e‑GLP‑1重组质粒A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57‑GLP‑1质粒；B酶切pMG36e，pUC57‑GLP‑1酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；C配制2％琼脂糖凝胶电泳，110V电压下电泳45min；在276bp和3600bp切胶回收；D酶连酶连体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；E转化a从‑80℃冰箱中取200μL MC1061感受态细胞悬液，冰上解冻；b加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；c 42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3‑5min；d向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，离心4000rpm，1min，弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；e将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含300ng/μL红霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16‑24h，挑取单克隆；F送公司测序；G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pMG36e‑GLP‑1，保存备用，步骤同步骤一；二、pMG36e‑GLP‑1电转乳酸乳球菌MG1363A乳酸菌感受态制备a取‑80℃冻存的乳酸乳球菌MG1363接种于5mL含有5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃过夜培养；b将获得菌液按照1％接种于含有2.5％Gly和5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃静置培养至菌体OD₆₀₀值为0.3‑0.4，收集备用；c将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；d沉淀用冰冷的10％蔗糖和10％甘油混合溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀；e最后沉淀重悬于1/100体积10％蔗糖和10％甘油混合溶液中，冰浴10min后使用；B乳酸乳球菌MG1363电转化a取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上述方法制备的50μL冰冷的乳酸菌感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μL的含5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃培养2h，取100μL转化后产物涂布在含有红霉素抗性的含5％葡萄糖的M17平板上，30℃静置培养24‑72h，筛选阳性克隆子；三、Western检测pMG36e‑GLP‑1在乳酸乳球菌中的分泌表达A电泳a配制12％SDS‑PAGE凝胶b样品处理将含有pMG36e‑GLP‑1的乳酸乳球菌MG1363培养36h‑48h，收集上清和沉淀；将上述收集的蛋白样品中加入浓度4×SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3‑5分钟，以充分变性蛋白；c上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS‑PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液使用碧云天生产的SDS‑PAGE电泳液；100V电泳90～120min；B Western检测a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜；条件为80V 45min；b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1‑2分钟，以洗去膜上的转膜液；c加入Western封闭液，即5％脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90分钟；d兔源GLP‑1多克隆抗体按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含一抗的5％脱脂牛奶中4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，TBST洗涤三次，每次10min；e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5％脱脂牛奶稀释；将蛋白膜转移至含二抗的5％脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min，TBST洗涤三次，每次10min；f显色液A液和B液各250μL 1:1避光混合，现配现用，曝光。