[发明专利]白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方法

摘要

本发明公开了白及中六种成分在Caco‑2细胞模型中吸收转运量的测定方法，包括以下步骤：制备白及提取物溶液、作为对照品的标准溶液和内标溶液；建立人源结肠腺癌细胞系Caco‑2细胞模型；通过Caco‑2细胞模型制备出细胞悬液；通过UPLC‑MS/MS测定6种成分的含量；按考马斯亮蓝染液蛋白测定试剂盒方法测定总蛋白含量，并计算细胞摄取量X=待测物总蛋白。本发明采用UPLC‑MS/MS建立白及提取物中6个成分的分析方法，测定白及提取物在时间、浓度、温度、pH和P‑gh抑制剂条件下对Caco‑2细胞的吸收摄取影响，初步评价白及提取物的体内吸收特性。为白及提取物的口服制剂研发提供科学依据。

主权项

1.白及中六种成分在Caco‑2细胞模型中吸收转运量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1：制备白及提取物溶液；步骤2：用α‑异丁基苹果酸α‑Isobutylmalic acid、4‑(葡糖糖氧基)‑肉桂酸葡萄糖氧基苄酯Blestroside、1,4‑二[4‑(葡萄糖氧)苄基]‑2‑异丁基苹果酸酯Militarine、4‑(葡萄糖氧)苄基‑2‑异丁基苹果酸酯Gymnoside、二氢菲Dihydrophenanthrene 1以及1,4‑二[4‑(葡萄糖氧)苄基]‑2‑异丁基苹果酸酯‑2‑[4‑O‑肉桂酰基‑6‑O‑乙酰基]葡萄糖苷Gymnoside Ⅸ制备作为对照品的标准溶液；步骤3：以葛根素配制内标溶液；步骤4：建立人源结肠腺癌细胞系Caco‑2细胞模型；步骤5：将步骤1得到的白及提取物溶液加入Caco‑2细胞模型在培养箱中培养，取出培养板吸走细胞表层的提取物以终止反应，用PBS溶液清洗两遍，加入细胞裂解液反复冻融以裂解细胞，超声处理后分别得到含有白及提取物溶液和系列标准溶液的细胞悬液；步骤6：取步骤5得到的含有白及提取物溶液的细胞悬液细胞悬液加入内标溶液，用乙腈沉淀蛋白，涡混，离心处理，通过UPLC‑MS/MS测定上清液中6种成分的含量；步骤7：取步骤5得到的含有白及提取物溶液的细胞悬液细胞悬液按考马斯亮蓝染液蛋白测定试剂盒方法测定总蛋白含量，并计算细胞摄取量X=待测物/总蛋白；步骤6中UPLC‑MS/MS测定时的液相条件如下：色谱柱：Waters BEH C18 ，2.1 mm×50 mm, 1.7 µm柱；保护柱：Waters Van Guard BEH C18 ，2.1 mm×5 mm, 1.7 µm；流速：0.35 mL·min‑1；柱温：45℃；流动相：0.1 %甲酸乙腈A‑0.1 %甲酸水溶液B；检测6种成分的梯度条件 0 ~ 3.0 min 5 %~65 % A，3.0~3.5 min 65 % ~ 90 % A，3.5~4.5 min 10 % A；进样体积 2 µL。