[发明专利]诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法

摘要

本发明公开一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，包括以下步骤：1)将hPSCs贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养；2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂；3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构；4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞；5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元；6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元。

主权项

1.一种诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将hPSCs贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养；2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂；3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构；4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞；5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元；6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元；所述步骤1)将hPSCs贴壁培养，待形成边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后消化制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养具体为：将hPSCs贴壁培养于在室温下用基质胶Vitronectin提前2小时包被过的培养皿中；hPSCs所用培养液为Essential 8，由体积比为50∶1的Essential8^TM Basal Medium与Essential 8^TM Supplement 50X配制而成；hPSCs在培养皿中增殖为边缘光滑，大小均一，内部致密的克隆后，加入1ml 1Uml^‑1Dispase于37℃，5％CO₂的孵箱中孵育2分钟，移至显微镜下观察，克隆边缘发亮，并微微卷起时，将Dispase吸除；用DMEM/F12轻洗细胞，10‑20s后吸走，再加入DMEM/F12轻轻将克隆吹下，一边吹一边将已吹下的克隆从液体中吸出转移至15ml离心管中；将装有细胞和DMEM/F12的离心管离心，800rpm，1min；吸除上清，将管底的细胞转移至细胞培养瓶，换上神经诱导培养液Neural induction medium，将细胞制成拟胚体，在神经诱导培养液中悬浮培养，其中，神经诱导培养液NIM为DMEM/F12培养基，NEAA，N2以体积比98∶1∶1配制而成；所述步骤2)在分化第1天加入腹侧化因子SHH的抑制剂，具体为：分化第1天在神经诱导培养液中加入腹侧化因子SHH的抑制剂Cyclopamine，浓度为2‑20μM，并且在分化第1‑3天时加入体积为培养 液体积5％的血清替代物KOSR，分化第1天至分化第4天，每天半换液，4天之后，隔天半换液，更换的培养液均为加入Cyclopamine的神经诱导培养液，持续至分化第25天；所述步骤3)在分化第7天进行贴壁，第10天得到神经管样细胞结构具体为：分化第7天时把拟胚体从培养瓶吸出置于离心管中，用头轻吹打2‑3次；待细胞自然沉降到管底后，吸走上清，留少量培养基，用枪将拟胚体吸出，置于细胞培养皿中，每个培养皿中大约含50个拟胚体，细胞培养液为1.5ml，由90％NIM+10％FBS配制而成；10小时后更换为加入Cyclopamine的神经诱导培养液；所述步骤4)在分化第16天将形成的神经管样细胞结构吹下，第17天将形成球状神经前体细胞，具体为：分化第16天，用1ml的枪将形成神经管样细胞结构吹下，转移至15ml离心管中自然沉降，弃上清，将管底细胞转移至细胞培养瓶中，培养液为加入Cyclopamine的神经诱导培养液，并在其中加入B27和Rock inhibitor；体积比为98∶2∶0.01；分化第17天，细胞将形成球状神经前体细胞；所述步骤5)在分化第20天将部分神经前体细胞贴壁，得到大脑皮质神经元具体为：分化第20天将神经前体细胞贴壁分化；在贴壁提前两小时在室温下用Matrigel包被用Poly‑l‑ornithine hydrobromide提前处理过的玻片，80ul/片；用1ml的枪吸出少量神经前体细胞于1.5ml的离心管中，使其自然沉淀，弃上清，加入1ml的TrypLE酶，置于37℃的孵箱中孵育6min；吸出TrypLE，加入1mlDMEM/F12重悬，待神经前体细胞自然沉降到管底后吸去上清；再加入500ulDMEM/F12，用200ul的枪头逐级吹打细胞；吸取10ul进行细胞计数，以4x10⁴个/ml的密度种于玻片上，每个玻片100ul，2hours后补液至500ul，培养液为NIM与B27，体积比为NIM∶B27＝98∶2；每隔一周半换液；剩余的神经前体细胞继续在培养瓶中培养，所用培养液仍然为含有Cyclopamine的神经诱导培养液；在分化第26天时，将Cyclopamine从神经诱导培养液中撤出，使用NIM神经诱导培养液；所述步骤6)在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁，加入神经营养因子培养，在分化90天后，获得谷氨酰胺能神经元具体为：在分化第28天将剩余神经前体细胞贴壁分化，在贴壁前两小时在室温下用Matrigel包被用Poly‑1‑omithine hydrobromide提前处理过的玻片，80ul/片；用1ml的枪吸出少量神经前体细胞于1.5ml的离心管中，使其自然沉淀，弃上清，用10ul的枪头将神经前体细胞吸出，按10个/玻片的密度种于玻片上，每个玻片100ul，2hours后补液至500ul，培养液为NIM，包含2％B27和神经营养因子10ng ml^‑1BDNF、1μM CAMP，每隔一周半换液，培养至第90天。