[发明专利]一种适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针及其制备方法

摘要

本发明公开的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针具有式(1)所示的结构。其制备步骤包括将聚乙二醇接枝到壳聚糖上得到适于血液长循环的聚乙二醇‑壳聚糖，再将四苯基乙烯荧光分子标记到壳聚糖链上得到具有聚集诱导发光特性的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针。本发明制得的荧光探针具有灵敏度高，光稳定性好，高浓度时无淬灭，荧光光谱不漂移等优点，适于血液长循环，在细胞示踪、肿瘤诊断、药物代谢检测等领域具有广泛的应用前景。

主权项

一种适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)在N2气氛下，将1g粘均分子量为1万—100万，脱乙酰度为60％—95％的壳聚糖和2.30g邻苯二甲酸酐加入到40mL N,N‑二甲基甲酰胺中，在130℃下反应5‑7小时，倒入冰水中沉淀，抽滤，沉淀用甲醇抽提，真空干燥，得到N,O‑邻苯甲酰化壳聚糖；2)将1.2g N,O‑邻苯甲酰化壳聚糖加入到100mL N,N‑二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中，N,N‑二甲基甲酰胺与水的体积比为95：5，在氮气氛围中加热到120℃，充分搅拌后，将产物置于冰水沉淀，抽滤，用甲醇抽提，真空干燥，得到N‑邻苯甲酰化壳聚糖；3)将0.5g N‑邻苯甲酰化壳聚糖溶于30mL质量浓度为5％氯化锂的N,N‑二甲基乙酰胺溶液，于0℃下预冷，备用；将9.5mL三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20mL N,N‑二甲基乙酰胺溶剂中，然后滴至上述备用的预冷液中，在4‑8℃下充分反应，将产物置于冰水中沉淀，过滤，用氯仿洗涤，常温下真空干燥，得到6‑对苯磺酸酯基‑N‑邻苯甲酰化壳聚糖；4)将0.20g 6‑对苯磺酸酯基‑N‑邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30mL N,N‑二甲基甲酰胺中溶解，80℃下充分反应，浓缩后滴加到蒸馏水中沉淀，过滤，真空干燥，得到6‑叠氮基‑N‑邻苯甲酰化壳聚糖；5)称取5g分子量为2000、甲基封端的聚乙二醇溶于20mL二氯甲烷，在0℃下边搅拌边加入0.15g氰化钠，待充分反应后再加入0.4mL溴丙炔，保持0℃继续搅拌至少2小时，然后加热到室温继续搅拌反应，将反应结束后的混合物置于水中，用二氯甲烷萃取，将萃取液蒸发后用苯溶解，乙醚沉淀，过滤，产物用乙醚洗涤，干燥，得到炔基‑聚乙二醇；6)将4.6mg五水硫酸铜溶于2mL水，7.3mg抗坏血酸钠溶于2mL水，0.28g‑1.11g炔基‑聚乙二醇溶于10mL水，分别配制成五水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和炔基‑聚乙二醇水溶液；将0.12g 6‑叠氮基‑N‑邻苯甲酰化壳聚糖溶于15mL二甲亚砜，得到6‑叠氮基‑N‑邻苯甲酰化壳聚糖的二甲亚砜溶液，将上述配制的五水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和炔基‑聚乙二醇水溶液加入到6‑叠氮基‑N‑邻苯甲酰化壳聚糖的二甲亚砜溶液中，在55℃下搅拌，充分反应后，蒸发除去其中的水；再在N2保护下，加入1mL一水合肼，在80℃搅拌反应，所得溶液用水透析除去杂质，之后浓缩，真空干燥，得到聚乙二醇‑壳聚糖；7)称取1.5g聚乙二醇‑壳聚糖加入到10mL二甲亚砜中，60℃下溶胀，然后加入含异硫氰酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物TPE‑ITC，TPE‑ITC/聚乙二醇‑壳聚糖的摩尔比为1％‑25％，继续搅拌，充分反应，将反应液放入透析袋中，先用体积比为1:1的四氢呋喃与水的混合溶液透析，再用水透析，除去杂质，冻干法干燥，得到适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针。