[发明专利]模拟植物悬浮细胞与其内生真菌代谢交流的共培养装置

摘要

本发明公开了模拟植物悬浮细胞与其内生菌体内代谢交流的体外共培养装置，其装置包括盛有培养基的培养瓶，一定分子量大小的透析袋，封口盖及其固定器。其中，透析袋垂直浸入液面一定深度，透析袋两端伸出瓶口，利用固定器将封口膜固定于培养瓶瓶口，透析袋内置有共培养的内生菌，袋外瓶内为植物悬浮细胞，培养瓶置于恒温震荡器中。通过缓慢的震荡培养，内生菌与悬浮细胞的信号因子由透析膜孔一端进入另一端，从而模拟了菌与植物之间交流的过程。本发明装置既模拟植物与内生菌的共生环境，又避免了植物细胞和内生真菌之间的相互混淆，可以分别收集细胞和菌体，并独立地进行观察和分析，操作简单，价格低廉。

主权项

1.一种植物悬浮细胞和内生菌的共培养装置的用途，所述用途为利用该装置对柴胡悬浮细胞及其内生真菌的交流信号进行检测并分析共培养对柴胡皂苷合成基因表达的影响，包括：/n步骤1 培养基的配置/n1.1 马铃薯蔗糖培养基的配置/n1.2 MS培养基母液的配置/n配置MS培养基时，一般将各成分归类，配置成母液，并于冰箱4℃储存，使用时再按照所配置的倍数稀释；以下为MS培养基母液的配方：/n大量元素母液(×20倍)/n /n微量元素母液(×200倍)/n /n有机成分母液(×200倍)/n /n /n铁盐母液(×100倍)/n /n前三种母液按照配方分别称取试剂，加入干净烧杯中，加入适量去离子水充分混匀后定容到500ml，置于储存瓶内，经高压蒸汽灭菌，待冷却后于4℃冰箱储存；/n铁盐母液的配置：将两者分别溶解于200ml去离子水中，在搅拌下混合均匀，最后加NaOH调节pH值至5.5，定容至500ml，直接储存于4℃冰箱；/nMS液体培养基的配置：在烧杯中加入适量的蒸馏水，量筒称取相应稀释倍数的母液加入其中，称取蔗糖3％(w/v)加入烧杯后，在搅拌器上混匀，定容；121℃灭菌20min；/nMS固体培养基的配置：向配置好的MS液体培养基中加入0.85％(w/v)琼脂，121℃灭菌20min；/n激素母液的配置：分别称取0.025g 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6-苄基腺嘌呤(6-RA)和激动素(KT)；其中2，4-D在碱性条件下使用Na0H溶解，6-BA和KT在酸性条件下使用HCl溶解，待充分溶解后加入去离子水定容至50ml，浓度为0.5mg/ml的激素母液，经0.22μm滤膜除菌，储存于4℃冰箱；/n步骤2 内生真菌的分离/n取新鲜健康的柴胡植株，用洗洁剂清洗材料表面，用自来水冲洗除去泥土大颗粒及表面浮灰，再用无菌蒸馏水冲洗干净；无菌条件下将实验材料放入75％乙醇中浸泡45s，无菌水冲洗4-5次，每次2min，再放入0.1％升汞溶液中浸泡3min，无菌水冲洗4-5次，每次2min；用无菌刀片将根切成5mm×5mm×5mm的小块，将茎切成5mm的小段，将叶切成5mm×5mm的小片；将切好的材料放入马铃薯蔗糖培养基中，每个平皿中放置4-5块，并尽量将切面贴于培养基；置于28℃恒温培养箱中，倒置，暗培养5-10天，观察材料切口处是否有真菌生长；/n每日定时观察材料，待材料切口处长出菌丝后，及时地挑取前端的菌丝，将其转接至新的马铃薯蔗糖培养基中培养，待菌落出现后，根据菌落形态和颜色的差异以及出现时间的不同，分别挑取各平板上菌落边缘的菌丝，将其接入新的马铃薯蔗糖培养基中进行分离培养；采用菌丝顶端纯化法逐步纯化柴胡内生真菌；将纯化的菌种编号，转入马铃薯蔗糖培养基斜面，置于4℃冰箱中保存；/n内生真菌孢子的收集：将内生真菌接种于马铃薯蔗糖培养皿中培养5-10天，观察菌落形态，当有大量孢子形成时，用移液器吸取2.5ml无菌MS液体培养基反复吸吹冲洗培养基的表面，然后吸取2ml洗下的孢子；取0.5ml稀释后孢子悬液用血球计数板计数，根据计数结果，取2ml的10⁶个/ml孢子加入48ml的MS液体培养基中备用，终体积50ml；本实验选取了能产生与宿主相同成分的内生真菌Alternaria alternate CH5作为与宿主代谢交流的菌株；/n步骤3 柴胡悬浮细胞制备/n本实验以狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium wild为对象，柴胡悬浮细胞来源于由柴胡无菌苗下胚轴诱导的愈伤组织；/n柴胡种子的萌发：采集的柴胡种子加入40℃的温水中，边浸泡边搅拌，浸泡12小时后，捞出浮在水面上瘪的种子，选取沉底的饱满的种子，用75％的乙醇溶液浸泡1min，再用0.1％升汞溶液消毒5min，无菌水清洗后，在无菌操作台中，用无菌水滴加入含有滤纸的并已预先灭菌的培养皿中，使其中滤纸润湿，把准备好的柴胡种子分散地放入平皿的湿润滤纸上；用封口膜封好，放入组织培养箱中25℃孵育7天进行萌发；/n愈伤组织的诱导：选取柴胡的下胚轴部位用自来水反复冲洗后，用75％的乙醇灭菌3min，再用0.1％的升汞消毒30s；无菌水冲洗三次，将下胚轴切成1cm的小段接种到6-BA3mg/l，2，4-D 0.1mg/l，KT 0.6mg/l的MS培养基，25℃，20天诱导愈伤组织；/n悬浮细胞系的建立：取松散的柴胡愈伤组织，接入6-BA 2.5mg/l，2，4-D 0.1mg/l，KT0.9mg/l的MS培养液中；每30ml溶液中加入5g愈伤组织；在25℃，120r/min的震荡培养箱中培养一周；/n采用上述方法能够有效地诱导产生柴胡的愈伤组织并以此制备悬浮细胞；/n步骤4 共培养模型的建立/n含有300ml MS培养基的500ml三角瓶中加入4g悬浮细胞，在高分子透析袋中加入步骤2中制备的50ml内生真菌孢子，透析袋中间呈U形插入装有悬浮细胞及培养基的三角瓶内；25℃、黑暗、120r/min恒温培养7天；以单独培养的悬浮细胞为对照，分别对细胞和内生真菌进行分析；在该共培养模型中，内生真菌的代谢产物能够透过透析袋进入三角瓶内与瓶内的宿主细胞接触，同时，宿主细胞的代谢产物也可进入透析袋中与透析袋内的内生真菌接触；在此共培养体系中，虽然被透析袋隔离的宿主悬浮细胞和其内生真菌处于相对独立的培养状态，而二者间的代谢交流却没有中断，在检测时，可有效地将宿主和其内生真菌分离进行独立的分析检测，进而在一定程度上模拟自然条件下柴胡内生真菌与宿主代谢交流的过程；/n步骤5 代谢交流检测/n5.1 对柴胡悬浮细胞中的cAMP环磷酸腺苷、cGMP环磷酸鸟苷和CaM钙调素交流信号分子分析/n取出共培养的悬浮细胞，真空抽滤，分别称取1g组织细胞置于-80℃预冷的研钵内迅速研碎至无明显颗粒状，加入5ml PBS缓冲液溶解，PBS缓冲液：NaCl 137mmol/l，KCl2.7mmol/l，Na₂HPO₄ 10mmol/l，KH₂PO₄ 2mmol/l，pH7.2～7.4，制成匀浆液；/na.cAMP和cGMP的提取：首先取13支经高压蒸汽灭菌处理的2ml离心管，分别向管内加入1ml PBS缓冲液，再将研磨完毕的匀浆液1ml加入离心管中，颠倒摇匀，3000×g离心20min，上清即含有cAMP和cGMP，小心吸取上清转入另一干净离心管，4℃保存待测；/nb.CaM的提取：取13支经高压蒸汽灭菌处理的2ml离心管，分别向管内加入1ml钙调素提取缓冲液，再将研磨完毕的匀浆液1ml加入离心管中，颠倒十次左右摇匀，4℃，10000×g离心30min，上清即为钙调素粗提液，又小心吸取上清转入另一干净离心管，4℃保存待测；/nc.狭叶柴胡悬浮细胞的cAMP、cGMP及CaM检测/n按照试剂盒说明书进行标准曲线的绘制及样品的检测；每个样品设三个复孔；具体操作方法如下：/n1)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；从第一、第二孔中各取出100μl分别加入到第三、第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三、第四孔中先各取出50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九和第十孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九和第十孔中各取50μl弃掉；/n2)加样：分别设空白孔及待测样品孔，空白孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同，在酶标包被板上待测样品孔 中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl，样品最终稀释度为5倍；加样将样品加于酶标孔板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；/n3)温育：用封板膜封板后置于37℃温育30min；/n4)配液：将20倍的浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；/n5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干；/n6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；/n7)温育：操作同3；/n8)洗涤：操作同5；/n9)显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15min；/n10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；/n11)测定：以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度OD值；测定应在加终止液后15min内进行；/n狭叶柴胡悬浮细胞内cAMP环磷酸腺苷、cGMP环磷酸鸟苷和CaM钙调素的标准曲线分别为：y＝0.0228x+0.0675，R²＝0.9888，y＝0.0234x+0.042，R²＝0.9947，y＝0.0228x+0.0476，R²＝0.9978，y为OD值，x为浓度ng/L，其R²均符合试剂盒要求R²＞0.95，可依据该标准曲线对所提取的样品进行定量分析；与CH5共培养后检测狭叶柴胡悬浮细胞的cAMP、cGMP及CaM的含量，见表1、2和3；经与狭叶柴胡内生真菌CH5共培养后，宿主悬浮细胞与空白组对比均有显著性差异p＜0.05；其数据结果表明内生真菌CH5能够分别提高细胞内钙调素和cGMP的浓度，降低了cAMP的含量；说明二者交流主要经钙离子和cGMP的信号调节，而cAMP的浓度降低表明cAMP可能没有参与二者间的交流调控；/n5.2 内生真菌与悬浮细胞的代谢交流对柴胡皂苷合成基因的影响/n采用Real-Time PCR即实时定量PCR检测交流模型中内生真菌CH5对柴胡悬浮细胞合成柴胡皂苷关键基因表达的影响；主要检测基因包括3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR、异戊烯基焦磷酸异构酶IPPI、法尼基焦磷酸合酶FPS、鲨烯合酶SS、β-香树脂素合成酶β-AS、鲨烯环氧酶ESE，β-actin为内标，引物序列参见下表；/nReal-Time PCR引物序列/n /n5.2.1 狭叶柴胡悬浮细胞中总RNA的提取/n准备工作：将经DEPC水处理后的1000μl、200μl、10μl的移液器枪头和1.5ml、200μl的EP管高压蒸汽灭菌20min，干燥箱内干燥；研钵、杵子、镊子需经180℃干热灭菌4h，其中研钵及杵子冷却后置于-80℃低冰箱内预冷，实验过程中必须戴一次性手套，以免污染，致使RNA降解；/n1)处理后的狭叶柴胡悬浮细胞，真空抽滤，蒸馏水冲洗两遍后，称取1g置于经180℃干热灭菌4h，-80℃预冷处理的研钵内，快速研磨至无明显可见颗粒的粉末，其间不断加入液氮；/n2)将30mg研磨完全的细胞加入1.5ml离心管，再向 每个离心管内加入1mlRNAisoPlus，移液枪吹打数遍，混匀，室温静置5min；/n3)12000×g，4℃离心5min；/n4)小心吸取上清液，移入另一新的离心管中，在向管内加入200μl氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s，待溶液充分乳化即无分层现象后，再室温静置15min；/n5)12000×g，4℃离心15min；/n6)离心结束，取出离心管，此时管内分为三层，无色上清液，中间的白色蛋白层和带有颜色的下层有机相，小心吸取上层转移至另一新的离心管中，切勿吸到白色中间层；/n7)向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温静置10min；/n8)12000×g，4℃离心10min；/n9)小心倾去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml，使用无水乙醇+DEPC水现用现配，轻轻上下颠倒数次洗涤离心管管壁，静置1min后，12000×g，4℃离心5min，小心倾去乙醇；/n10)室温干燥离心管5分钟，加入50μl的RNase-Free水溶解沉淀，待RNA完全溶解后，于-80℃保存，备用；/n5.2.2 提取的狭叶柴胡RNA浓度及纯度检测/n将提取的RNA在紫外分光光度计波长260nm检测；并计算OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值；/n配制1.0％的琼脂糖凝胶，取狭叶柴胡总RNA5μl与溴酚蓝上样缓冲液1μl混匀，电压100V，在1×TAE溶液中电泳30min，取出凝胶放入凝胶成像仪内，在紫外光下观察RNA条带并拍照；/n5.2.3 Real-Time PCR检测柴胡皂苷合成基因的表达/n逆转录合成cDNA的操作按照Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒说明书进行微小改动，每个样品实验重复三次；/n1)基因组DNA的除去反应：配置20μl反应体系，取RNase-Free200μl离心管，依次加入2μl 5×gDNA Eraser Buffer，1μl gDNA Erase，1μl(即0.4μg)DEPC水，6μl总RNA，然后使用移液枪吸打混匀，室温放置10min；/n2)室温放置步骤1反应液时，取另一支200μl RNase-Free离心管，按所需反应+1的量配制Master Mix：4μl 5×Prime Script Buffer2，1μl Prime Script RT Enzyme Mix 1，1μlRT Primer Mix，4μl RNase-Free dH₂O/n待步骤1反应结束，将配置完毕的Master Mix混匀后，分装到每个反应管中制成20μl反应体系，放入PCR仪，反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃→∞；/n3)步骤2反应合成cDNA时，于冰上配置Real-Time PCR反应液，操作按照SYBR PremixEx TaqTM即TaKaRa试剂盒说明书进行稍微改动，按所需反应数+1的量配制Real-Time PCR反应液：SYBR12.5μl，dH₂O8.5μl，混匀后每管21μl分装至八联管，再向管内加入上游引物和下游引物各1μl以及步骤2中反应得到的cDNA溶液2μl，制得25μl的反应体系，最后将八联管装入Real-Time PCR仪内，关上盖，进行实时定量PCR；PCR扩增反应条件为：95℃预变性30S；95℃变性5S；60℃退火30S，40个循环；采集荧光信号，采用相对定量法对实验数据进行分析；/n5.2.4 Real-Time PCR结果与数据分析/n将与内生真菌共培养的柴胡悬浮细胞中提取的总RNA，采用Real-Time PCR法，以β-actin作为内参，检测共培养前后狭叶柴胡悬浮细胞中HMGR、IPPI、FPS、SS、β-AS、ESE等6个三萜皂苷合成的关键酶基因表达量的差异；并采用2-ΔΔCt法对数据进行分析，其公式如下：/nΔCt(目的基因)＝Ct(目的基因)-Ct(同一样本的内参基因)/nΔΔCt(目的基因)＝ΔCt(实验组目的基因)-ΔCt(空白组目的基因)/n相对倍数(实验组/空白组)＝2^-ΔΔCt(目的基因)/n因此若2^-ΔΔCt值大于1则表示该目的基因与空白组对比基因表达量上调，反之则下调；数值越大表明实验组表达水平越高，反之亦然；/n结果见表5可看出，内生真菌CH5菌液处理后，基因β-AS、IPPI、FPS、SS四个基因均上调，ESE及HMGR基因均被下调，其中β-AS和SS上调较大，是空白组表达的大约5倍，FPS为2倍左右，而IPPI上调幅度很小，几乎与空白组持平；菌丝体的实验组中，上调及下调幅度不及菌液大，β-AS、ESE及SS上调将近2倍，HMGR和IPPI均被下调三倍左右，FPS几乎持平；说明内生真菌CH5的代谢产物能够影响柴胡细胞内柴胡皂苷的合成。/n