[发明专利]基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的溶栓药及其应用

摘要

基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶，所述蛋白酶是从中华眼镜蛇又称舟山种眼镜蛇，分类名：Naja atra的蛇毒中分离纯化获得；所述蛋白酶是单链糖蛋白，结构解析表明具有3个结构域：金属蛋白酶结构域、去整合素样结构域、富含半胱氨酸结构域，属于PIII型蛇毒金属蛋白酶。其名称分别为Atrase A和Atrase B，其序列为：AtraseA：SEQ ID No.1；AtraseB：SEQ ID No.2。目标蛋白和其溶栓药能诱导内源性纤溶酶原激活剂tPA释放从而具有溶栓作用，可用于血栓性疾病的溶栓治疗。

主权项

1.基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的溶栓药，其特征在于，所述蛋白酶是从中华眼镜蛇又称舟山种眼镜蛇，分类名：Naja atra的蛇毒中分离纯化获得；所述蛋白酶是单链糖蛋白，结构解析表明具有3个结构域：金属蛋白酶结构域、去整合素样结构域、富含半胱氨酸结构域，属于PIII型蛇毒金属蛋白酶；所述基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶，其名称分别为Atrase A和Atrase B，其中Atrase A推导分子量为46717.14，等电点为7.281；Atrase B推导分子量为44749.39，等电点为7.238；两序列的核苷酸相似度为85.9％，氨基酸相似度为65.4％，其序列为：AtraseA：SEQ ID No.1；AtraseB：SEQ ID No.2；所述基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶具有水解纤维蛋白原α链的活性，该活性能被金属螯合剂EDTA、EGTA、1,10‑phenanthroline和还原剂DTT完全抑制；目标蛋白Atrase A和Atrase B的精确分子质量分别为49.3kDa和49.4kDa，但依据不同的测定方法其表观分子量有所不同，范围在45kDa‑65kDa之间：Atrase A在还原性和非还原性SDS‑PAGE中分别为64.6和57.1kDa，凝胶过滤方法测定为56.5kDa；Atrase B在还原性和非还原性SDS‑PAGE中分别为62.2和55.8kDa，凝胶过滤方法测定为54.3kDa,等点聚焦的测定结果表明，变性条件下目标蛋白Atrase A和Atrase B的等电点分别为9.6和9.7，目标蛋白没有水解酪蛋白活性，也没有精氨酸酯酶活性和纤维蛋白水解活性；目标蛋白含有糖基，其中性糖含量为5％；所述基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶的溶栓药其由上述基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶添加其他助剂制成的冻干粉针剂；所述溶栓药由下述组分组成：基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶，磷酸钠、精氨酸、吐温80；溶栓药冻干粉针剂复溶后由下述组分组成：pH为7.4的0.01M磷酸钠缓冲液0.5ml中含有基于眼镜蛇毒PIII型金属蛋白酶纯化样品0.5mg、质量分数为0.15％的精氨酸、质量分数为0.01％的吐温80。