[发明专利]卷烟烟气有害成分诱导细胞氧化应激ROS的测定方法

摘要

本发明涉及卷烟烟气的体外毒理学研究，具体是一种卷烟烟气有害成分诱导细胞氧化应激ROS的测定方法，其特征在于：是利用荧光探针2ˊ,7ˊ‑二氢二氯荧光素二乙酸酯（DCFH‑DA）检测细胞氧化损伤后胞内活性氧ROS水平，包括以下具体步骤：1）配置实验试剂；2）细胞接种培养；3）、DCFH‑DA探针装载；4）、卷烟烟气有害成分染毒；5）、ROS检测。本发明的最大特点是可快速、灵敏地检测卷烟烟气有害成分诱导的细胞氧化损伤程度，对研究卷烟烟气有害成分对于诱导细胞内活性氧ROS的影响有非常重要的意义。

主权项

一种卷烟烟气有害成分诱导细胞氧化应激ROS的测定方法，其特征在于：是利用荧光探针2ˊ,7ˊ‑二氢二氯荧光素二乙酸酯（DCFH‑DA）检测细胞氧化损伤后胞内活性氧ROS水平，包括以下具体步骤：1）配置实验试剂：(1)生长培养液，(2)无血清培养液，(3)荧光探针DCFH‑DA，(4) 磷酸缓冲盐溶液PBS；2）细胞接种培养：经扩增培养的人肺腺癌细胞A549或人肝癌细胞HepG2经胰酶消化后，制备细胞悬液1.5×10⁵ 个/ml，96孔板每孔加入100 μl细胞悬液，于37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h；3）、DCFH‑DA探针装载：96孔板中的细胞培养24h后，弃去培养基，无血清培养液洗涤1次，每孔加入100 μl含有10μMDCFH‑DA的无血清培养液，在37℃， 5％CO₂条件下孵育1 h，弃去上清并用无血清培养液洗涤三次，以充分除去多余探针；4）、卷烟烟气有害成分染毒：使用无血清培养液将卷烟烟气有害成分纯品母液稀释到不同浓度，设置至少两个非零浓度使细胞存活率在80%以上，染毒2 h；5）、ROS检测：细胞染毒2 h后，弃去上清，每孔加入PBS洗涤两次，在488 nm激发波长，525 nm发射波长处，用荧光酶标仪测定荧光强度。