[发明专利]利用免疫共沉淀与Western blot技术相结合来检测血清中蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种利用免疫共沉淀与Western blot技术相结合来检测血清中蛋白的方法。取Dynabeads Protein G超纯水清洗，用EBC裂解液再清洗，溶于EBC裂解液中平均分成两份，对两份Dynabeads Protein G溶液进行分别孵育处理，再混合孵育获得产物，产物弃上清用EBC裂解液清洗三次，得到的沉淀用EBC裂解液重悬，再加入SDS上样缓冲液煮沸，用Western blot方法检测目的蛋白。本发明方法简单有效，特异性好，且准确率极高。因此避免了传统的用于血清中蛋白检测的ELISA方法产生的背景高，准确性低等缺点。

主权项

1.一种利用免疫共沉淀与Western blot技术相结合来检测血清中蛋白的方法，其特点在于包括以下步骤：1)取40～60μl Dynabeads Protein G，超纯水清洗三次后，用1ml的EBC裂解液再清洗两次，将清洗后的Dynabeads Protein G溶于200μl的EBC裂解液中，平均分成两份；2)对两份Dynabeads Protein G溶液进行分别孵育处理，再混合孵育获得产物；所述步骤2)具体为：2.1)取50～100μl新鲜的或者冻存于‑80℃冰箱的人血清，与900μl EBC裂解液混匀，与其中一份Dynabeads Protein G溶液混匀，4℃轻摇1～2h；2.2)另一份Dynabeads Protein G溶液加EBC裂解液补齐至1ml，之后与蛋白的抗体混匀，4℃轻摇1～2h；2.3)收集步骤2.1)的上清部分和步骤2.2)的沉淀部分，将两者混合，4℃轻摇过夜；3)将步骤2)得到的产物弃上清，用EBC裂解液清洗三次，得到的沉淀用50～100μl EBC裂解液重悬，再加入SDS上样缓冲液在100℃煮沸10min；4)用Western blot方法检测步骤3)得到的产物，检测目的蛋白；所述步骤2)所有孵育的过程都在4℃下进行，所有孵育的体系中都包含了蛋白酶抑制剂。