[发明专利]运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法

摘要

本发明公开了一种运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法，包括以下步骤：（1）三叶青真伪差异序列的获得以及待测物PCR产物的获取；（2）对待测物PCR产物采用链置换循环信号放大技术比色可视化来鉴定三叶青真伪，具体是通过酶切链置换循环反应使得体系中产生大量能形成G‑四链体的富G序列，在K⁺和Hemin存在下形成G‑四链体‑hemin DNA模拟酶，此酶具有类似辣根过氧化物酶的活性能催化ABTS^2‑‑H₂O₂体系显色。从而实现可视化鉴别三叶青真伪。本发明成本低，DNA培育方法简单，重现性好；稳定性好，且避免了凝胶电泳分析节省了大量时间能够直接用于快速可视化鉴别三叶青真伪，有望在药材市场及食品安全领域得到广泛应用。

主权项

1.一种运用DNA模拟酶高效可视化鉴别三叶青真伪的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A、三叶青真伪品DNA的提取：分别采用植物DNA提取CTAB法来提取三叶青真品和三叶青伪品的DNA；步骤B、三叶青真伪品ITS2 DNA序列的获得：通过对提取的三叶青真伪品DNA进行PCR特异性扩增以获得三叶青真伪品的ITS2 DNA序列，其中扩增所用到的引物为已经报道的被子植物的ITS2序列的通用引物，其正向引物为5’—ATGCGATACTTGGTGTGAAT—3’；反向引物为5’—GACGCTTCTCCAGACTACAAT—3’；步骤C、三叶青真伪品差异序列的获得：分别对上述三叶青真伪品ITS2DNA序列进行测序，测序结果用DNAstar软件进行序列比对获得了三叶青真伪品差异序列，其中三叶青真品差异序列为5’—TTTTAACCAACCACGGATGCGATGTTCCAT —3’，三叶青伪品差异序列为5’—ACCCTACGCAACGCTACCGTGAGACATTTG—3’；步骤D、待测物PCR产物的获得：提取三叶青待测物的DNA，然后对该待测物的DNA序列进行PCR特异性扩增以获得待测物PCR产物，其中所用到的上游引物的核苷酸序列为：5’—AAGGGAATCCTTGTAAGTTTCTTTT— 3’，下游引物的核苷酸序列为：5’—AACATCGCATCCGTGGTTGGTTAAA —3’，所述上游引物的核苷酸序列和下游引物的核苷酸序列均是通过三叶青真伪品差异序列而设计的；步骤E、三叶青真伪鉴定：对待测物PCR产物采用链置换循环信号放大技术比色可视化来鉴定三叶青真伪，其具体包括以下步骤：1）、待测物PCR产物与DNA探针杂交：先将DNA探针用HEPES缓冲液配成100μM溶液，其中DNA探针为5’—CCCAACCCGCCCTACCCAACCTCAGCATGGAACATCG —3’，后将待测物PCR产物和DNA探针分别在90℃加热5min以去除其自身二级结构，冷却至室温后在预装有DNA探针的2个离心管中分别加入二次蒸馏水和待测物PCR产物，在37℃下杂交培育40min；2）、酶切链置换产生富G序列：杂交完后，随后分别加入4μL dNTP_S、0.2μL Klenow Fragment exo^‑聚合酶、0.2μL Nb.BbvCI内切酶、2μL10×反应缓冲液1、2μL10×反应缓冲液2，最终加入二次蒸馏水使得体系达到20μL并于37℃反应40min，其中所述HEPES缓冲液的pH为7.4，其中包含200mM 氯化钠和20mM氯化钾，所述反应缓冲液1为10×reaction buffer ，具体是pH为8.0的500mM Tris‑HCl缓冲液，其中包含50mM 氯化镁和10mM二硫苏糖醇；所述反应缓冲液2为10×NEBuffer；3）、酶终止反应：反应结束后立即将温度上升至80℃恒温20min使得酶失活；4）、G‑四链体‑hemin DNA酶的培育：冷却至室温，加入0.8μL hemin于37℃培育1h以形成G‑四链体‑hemin DNA酶；5）、比色可视化鉴定：培育结束后加入6μL ABTS、1μL H₂O₂加入HEPES缓冲液至体系为200μL，观察颜色变化，其中只有三叶青真品的DNA序列才能使体系显绿色。