[发明专利]一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法

摘要

一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法，它涉及一种建立干细胞库的方法。步骤如下：分离脐带华通胶，加入无血清培养基中培养，每5天更换一次培养基，待细胞长满至70％，传代；重新收集组织块，加入无血清培养基中二次培养，每5天更换一次培养基，待细胞长满至70％，传代。经传代培养，冻存后建立脐带间充质干细胞库。本发明采用了无血清培养、冻存体系建立细胞库，以及组织块二次爬片方法。本发明优势在于有效利用所有组织，让细胞尽可能的爬出，获得细胞数量是传统方法的2倍。本发明细胞培养体系采用血清替代物替代牛源血清，胰酶替代物替代猪源胰酶，有效的避免了动物源性对人源的污染，省去了检测牛源、猪源的质控环节。

主权项

一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法，其特征在于它是按照以下按照以下步骤进行的：一、分离脐带华通氏胶：将脐带剪成1～3cm，剥离血管和表皮，分离出华通氏胶；二、组织块培养及细胞传代：将步骤一分离的脐带华通胶剪成小块，加入到无血清培养基中培养，每5天更换一次培养基，待细胞密度达到70％，悬浮组织块并收集，然后离心，弃上清，加入胰酶替代物，消化3min，再加入生理盐水，收集细胞悬液，离心，重悬细胞；三、将步骤二重悬细胞进行离心，弃上清，用无血清培养基进行重悬，进行二次培养，每5天更换一次培养基，待细胞密度达到70％，悬浮组织块并收集，然后离心，弃上清，加入胰酶替代物，消化3min，再加入生理盐水，收集细胞悬液，离心，重悬细胞；四、将步骤三的重悬细胞细胞进行离心，然后用细胞冻存液重悬至细胞密度为1～2×10⁶/mL，分装在冻存管中，然后将冻存管放入程序降温盒中，‑80℃过夜保存后可转入液氮罐中长期保存，即完成所述的采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的主细胞库；五、将步骤四的细胞继续进行传代培养，接种于T175培养瓶中，接种密度为1.5×10⁴/mL，细胞接种量为3×10⁵个，每瓶加入20mL无血清培养基，第3天将培养瓶内的一半培养基更换为新鲜无血清培养基，培养至细胞密度达95％，消化细胞后计数细胞数量达6～8×10⁶个后，进行传代培养至P4代，即完成建立人脐带间充质干细胞库。