[发明专利]一种利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法

摘要

本发明提供了一种利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法。为了获得高产花生四烯酸的高山被孢霉菌株，本发明利用原生质体融合的方法，将两种具备不同优良特性的高山被孢霉进行融合处理，并结合荧光染色方法对融合子筛选。其具体步骤包括：两亲本菌株的培养、两亲本菌株原生质体的制备、两亲本菌株原生质体的荧光染色、两亲本菌株原生质体的融合及融合子的筛选及验证。本发明所述方法操作简单，过程易实现，育种成功几率高。该方法可用于提高花生四烯酸生产菌的产量水平、优化花生四烯酸产品的油脂组分和改良菌种性状等用途。

主权项

一种利用原生质体融合结合荧光染色筛选融合子选育AA高产菌株的方法，其特征在于，将两种具备不同优良特性的高山被孢霉进行融合处理，并结合荧光染色方法对融合子筛选，具体包括以下步骤：（1）两亲本菌株的培养分别将两种具备不同优良特性的高山被孢霉接于PDA固体培养基培养5‑7天，将孢子刮下，用无菌水制备孢子悬液， 稀释至 10⁸ 个孢子 /ml，取 1ml孢子悬液分别接入250ml的两个三角瓶中，每个三角瓶中都装有50ml PDA液体培养基， 28℃，150 r/min 振荡培养12‑24h，制得两亲本菌株；（2）两亲本菌株原生质体的制备将步骤（1）获得的菌丝体，用无菌水洗涤离心2‑3次，再用NaCl溶液 洗涤1‑2次并离心，取1mg离心获得的湿菌体加入5ml混合酶解液里， 轻摇使离心后的菌体和酶解液充分混合，再置于 28‑32℃、 转速 70‑150r/min的恒温摇床中，酶解2‑6h，酶解液用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，于4℃，5000r /min 离心8‑10min，弃上清留沉淀，沉淀用NaCl溶液洗涤,2‑3次后离心获得原生质体；（3）两亲本菌株原生质体的荧光染色将得到的两亲本原生质体分别悬浮于5mLPBS缓冲液中，一个瓶加入lμL的DiL荧光染色剂，另一个瓶中加入lμL DiO 荧光染色剂，37℃避光温育30min，离心去除染色剂，并用PBS缓冲液洗涤2‑3次，然后分别加入到等量的 NaCl溶液中悬浮；（4）两亲本菌株原生质体的融合取步骤（3）得到的等量的荧光染色的两亲本原生质体悬液，加入到离心管内混合，于4℃，5000r/min 离心10min，弃上清留沉淀，向沉淀中加入 5ml融合剂，轻轻摇匀，于25‑35℃静置30‑90min，离心后沉淀用NaCl溶液洗涤2‑3次并悬浮，获得悬浮液；（5）融合子的筛选及验证在倒置荧光显微镜下观察，同一视野下绿色激发光下看到菌体呈橙黄色，蓝色激发光下看到菌体呈绿色，二者组合后呈红色的即为融合子，观察并计算融合率，显微操作吸取融合子涂布于再生平板，于28℃倒置培养2‑5d，挑取融合原生质体在再生培养基上的菌落，转接到另一再生平板培养，待长出菌丝后转接到PDA培养基茄瓶中培养，使孢子大量生长，制备孢子悬液，接种瓶，于25‑30℃， 湿度 30－60% 条件下培养2‑4d，摇床转速为180‑250rmp，将种子液按 5‑10% 的接种量接入含有发酵培养基的三角瓶中，同样条件培养8‑14d，检测花生四烯酸产量。