[发明专利]一种将spacer序列克隆至CRISPR-Cas9系统中的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种将spacer序列克隆至CRISPR‑Cas9系统中的方法及其应用。本发明的方法包括如下步骤1)改造表达sgRNA的载体、设计合成可退火形成带有粘末端片段的单链DNA分子A和单链DNA分子B；2)将单链DNA分子A和单链DNA分子B退火，形成带有酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和酶切识别位点B粘末端的片段丙；3)将片段丙通过酶切连接替换改造后表达sgRNA的载体中的酶切识别位点A和酶切识别位点B之间的片段，得到重组载体，实现靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体。通过实验证明本发明提供的方法可以有效并快速的将spacer序列克隆至表达sgRNA的载体。

主权项

一种将靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体中的方法，包括如下步骤：1)改造表达sgRNA的载体、设计合成可退火形成带有粘末端片段的单链DNA分子A和单链DNA分子B；所述改造表达sgRNA的载体通过包括如下步骤的方法进行：突变表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游且紧邻回文序列第一个碱基的碱基，使突变后碱基与所述第一个回文序列自5’末端起5个碱基形成能产生粘末端的酶切识别位点B，得到改造后表达sgRNA的载体；所述表达sgRNA的载体中含有如下表达盒：从5’端起依次包括启动子、能产生粘末端的酶切识别位点A和用于结合Cas9蛋白的ncRNA编码DNA分子，所述启动子启动所述ncRNA的表达；且所述表达sgRNA的载体不含有酶切识别位点B；所述单链DNA分子A从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和DNA片段乙组成；所述单链DNA分子B从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点B粘末端、DNA片段乙反向互补片段和靶基因spacer反向互补片段组成；所述DNA片段乙为所述表达sgRNA的载体中位于所述酶切识别位点A和所述第一个回文序列之间的片段；2)将所述单链DNA分子A和所述单链DNA分子B退火，形成带有酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和酶切识别位点B粘末端的片段丙；3)将所述片段丙通过酶切连接替换所述改造后表达sgRNA的载体中的所述酶切识别位点A和所述酶切识别位点B之间的片段，得到重组载体，实现靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体。