[发明专利]一种枸杞花药诱导培养基及花培育种方法

摘要

本发明公开了一种枸杞花药诱导培养基及花培育种方法，属于枸杞的组织培养领域。本发明所筛选的枸杞花药愈伤组织诱导培养基含有大量元素、微量元素、铁盐及络合剂、有机成分、无机添加物、植物生长调节剂、生理活性物质、碳源、凝固剂及其它添加物等。本发明的枸杞花培育种方法步骤包括花蕾取材与低温处理、培养基的配制、花药接种、变温诱导培养、分化与生根、驯化与移栽等。采用本发明对枸杞花药进行诱导培养，可以有效提高花药愈伤诱导率，所获得的枸杞花药愈伤质量高，可以在短期内形成大量优良的试管苗，大大加快了枸杞育种进程。本发明不仅可以用于枸杞花培育种，还可以应用于枸杞离体快繁、种质保存等领域。

主权项

一种枸杞花培育种方法，其特征在于，枸杞花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：KNO3 900～1100mg/L，NH4NO3 900～1100mg/L，KH2PO4 270～330mg/L，Ca(NO3)2∙4H2O 330～360mg/L，KCl60～70mg/L，Na2‑EDTA∙2H2O 70～80mg/L，FeSO4∙7H2O 50～60mg/L，MnSO4∙4H2O 4.0～5.0mg/L，ZnSO4∙7H2O 2.1～2.3mg/L，H3BO3 2.3～2.7mg/L，KI 1.1～1.3mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl2∙6H2O 0.02～0.03mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L，AgNO3 23～27mg/L，肌醇90～110mg/L，维生B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.09～0.11mg/L，烟酸0.45～0.55mg/L，维生素C 28～32μmol/L，胰岛素2.3～2.7mg/L，叶酸0.18～0.22mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，脯氨酸0.3～0.4mg/L，天冬氨酸0.35～0.45g/L，N‑甲基‑亚硝基脲30～36mg/L，麦芽糖25～30g/L，果糖15～20g/L，琼脂6.5～7.5g/L；2，4‑D 0.5～0.7mg/L，复酞核酸0.2～0.3mg/L，比久0.5～0.6mg/L，甘露醇25～35g/L，水解蛋白0.25～0.35g/L，活性炭0.35～0.45g/L，枸杞根提取液35～45g/L；所述枸杞根提取液的获取方法为：将枸杞根洗净后称取30g，切成碎片，加入100ml蒸馏水，煮沸30min，用4～6层纱布过滤静置，待沉淀后将取上清液；所述N‑甲基‑亚硝基脲的添加方法为：配制好N‑甲基‑亚硝基脲溶液后，用灭菌的0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，待未添加N‑甲基‑亚硝基脲的枸杞花药诱导培养基高压蒸汽灭菌后冷凝到45～55℃时，取出置于超净工作台中，无菌操作，加入N‑甲基‑亚硝基脲溶液，摇匀冷凝，48h内接种；所述枸杞花培育种方法，其特征在于按如下步骤操作：（1）花蕾取材与低温处理在大田常规栽培的枸杞处于初花期或盛花期时，上午9点～11点采集生长健壮、无病虫害的植株上取发育时期处于单核中晚期的花蕾为试材，将采集的花蕾用湿纱布包裹后再用自封塑料袋套起，置于4℃冰箱低温处理2～7d；（2）培养基的配制将未添加N‑甲基‑亚硝基脲的枸杞花药诱导培养基配制好后分装于200ml的三角瓶中，每瓶盛40ml～60ml，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，冷凝到45～55℃时，取出置于超净工作台中，无菌操作，加入N‑甲基‑亚硝基脲溶液，摇匀冷凝，48h内备用；（3）花药接种取出低温处理后的花蕾，先用流水冲洗1～2 min，用镊子剥去花柄，在70%酒精中浸泡10s，用无菌水冲洗2～3次，再用0.1%升汞+2滴吐温‑80溶液浸泡10min，无菌水冲洗4～6次后将花蕾放入覆有滤纸的灭菌培养皿内，在无菌条件下用消过毒的镊子剥取花药，接种于步骤2配制好的枸杞花药诱导培养基上，每瓶接种4～6个花蕾的花药；（4）变温诱导培养将接种花药后的培养基置于温度25～27℃的环境下暗培养1.5～2.5d，然后转入37～39℃高温、黑暗条件下热激处理2～3d，然后转入温度为27～29℃、湿度为75%～80%黑暗条件下诱导培养，诱导出花药愈伤；（5）分化与生根待愈伤长至直径2cm后，挑选淡黄色松散型的愈伤组织转接入分化培养基上进行分化培养，愈伤逐渐分化出绿苗，将苗长高于2.5cm的绿苗带根切下，转接入生根培养基上生根壮苗；（6）驯化与移栽待试管苗长到3～5叶龄时，将封口膜打开驯化炼苗，7～10d后将试管苗取出，将根部清洗干净，移栽入含有草炭土的营养钵中，经常浇水，保持湿度，小苗长大后，移栽到大田，常规栽培。