[发明专利]一种检测芒果露水斑病菌的方法

摘要

本发明公开了一种检测芒果露水斑病菌的方法，包括对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；采用ITS1/ITS4做外侧引物，ML‑SF9和ML‑SR5做内侧及ML‑SF10和ML‑SR10做内侧引物进行巢式PCR反应；电泳检测，判断结果。本发明的检测芒果露水斑病菌的方法克服了常规PCR检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、反应稳定的优点，检测下限至少可达到3.55×10‑10ng/μl，易操作，用时短，只需4‑6h。

主权项

1.一种检测芒果露水斑病菌的方法，其特征在于，所述检测芒果露水斑病菌的方法包括：步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；步骤二、采用真菌通用引物ITS1和ITS4做外侧引物，引物对ML‑SF9和ML‑SR5或引物对ML‑SF10和ML‑SR10做内侧引物进行巢式PCR反应；步骤三、电泳检测，判断结果；2对内侧引物，分别是ML‑SF9和ML‑SR5，ML‑SF10和ML‑SR10，序列如下：ML‑SF9：5′‑TAGCCTCCCGAGCACCCTT‑3′；ML‑SR5：5′‑GTTCATAACCCTTTGTTGTCC‑3′；ML‑SF10：5′‑TAGCCTCCCGAGCACCCTTT‑3′：ML‑SR10：5′‑GTTTACCACCGGGATGTTCATAAC‑3′；所述的外侧引物和内侧引物浓度均为10μmol/L；巢式PCR第一轮反应具体如下：25μL反应体系：2×Taq PCR MasterMix，12.5μl，外侧引物ITS1和ITS4各1μl，DNA模板1μl，灭菌ddH2O加至25μl，设置阳性对照反应时，用芒果露水斑病菌基因组总DNA作为模板；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替模板；反应在Biometra 050‑901PCR仪上进行，94℃预变性3min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延长1min，进行30个循环；72℃延长10min；巢式PCR第二轮反应具体如下：25μL反应体系：2×Taq PCR MasterMix12.5μl，内侧引物ML‑SF9和ML‑SR5各1μl，或者内侧引物ML‑SF10和ML‑SR10各1μl，用巢式PCR第一轮反应产物1μl做模板，灭菌ddH2O加至25μl；设置阳性对照反应时，用芒果露水斑病菌总DNA作为模板；设置阴性对照反应时，用无菌ddH2O代替模板；反应在Biometra 050‑901PCR仪上进行，94℃预变性4min；94℃变性45sec，63℃退火45sec，72℃延长1min，进行36个循环；72℃延长10min；反应结束后，取5μL反应产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色观察结果。