[发明专利]一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法

摘要

本发明公开了一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，该方法利用连接酶连接与待测核酸互补的含有茎环结构的探针形成双茎环结构DNA模板，该模板可以引发快速、高效的环介导等温扩增反应，从而实现高灵敏度的核酸检测，同时该方法能够特异性地区分含有单碱基差异的核酸。本发明首次提出通过高特异性的连接反应构建双茎环结构DNA，为下一步环介导等温扩增反应提供了特异性的扩增模板，该方法无需荧光标记，成本低廉，避免了PCR过程精确的热循环过程，在恒温条件下即可实现待测核酸的快速扩增。本发明能够用于RNA或DNA的定量分析、甲基化检测、SNP检测等，为高灵敏的核酸分析及癌症早期诊断等研究提供了新的策略。

主权项

1.一种基于连接反应构建双茎环结构DNA模板检测核酸的方法，其特征在于它由下述步骤组成：(1)根据待检测核酸序列，设计并合成具有茎环结构的探针A和探针B，其中探针A从5′端到3′端依次为茎环区、检测识别区，探针B从5′端到3′端依次为检测识别区、茎环区且其序列的5′端修饰磷酸基团；(2)将探针A、探针B的检测识别区与待检测核酸杂交，然后通过连接酶将探针A和探针B连接起来形成双茎环结构DNA；(3)以双茎环结构DNA为模板进行环介导等温扩增反应，并加入SYBRGreenI荧光染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线即可实现核酸的检测及定量分析；上述的待检测核酸为let-7a时，探针A的碱基序列为5′-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTAACTATACAAC-3′，探针B的碱基序列为5′-CTACTACCTCATTTTATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTTCAGTCACGACGAT-3′；上述的待检测核酸为以人P53基因外显子8的突变型DNA片段，突变型DNA序列为5′-TGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACTGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTC-3′时，探针A的碱基序列为5′-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGCTCTTCCTCTGTGCGCCA-3′；探针B的碱基序列为5′-GTCTCTCCCAGGACAGGCATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTTCAGTCACGACGAT-3′。