[发明专利]一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法及应用和该构建方法的筛选方法

摘要

本发明涉及一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法，步骤如下：⑴利用高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量；⑵确定最佳的给药培养方式；⑶确定最佳的给药物质、给药剂量；⑷确定黄嘌呤的最佳给药时间；⑸对该构建方法所获得的高尿酸秀丽隐杆线虫模型进行系列实验评价，获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。本方法利用与人类基因具有高保守性，且尿酸代谢途径与人类很相似的模式生物—秀丽隐杆线虫建立了高尿酸血症动物模型，该模型具有典型的病理表征、稳定、可靠，且各项数量指标具有统计学意义，为痛风及高尿酸症的大规模、高通量药物筛选提供了有力的工具。

主权项

1.一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法，其特征在于：步骤如下：利用秀丽隐杆线虫，采用前体物质黄嘌呤、终浓度为0.25‑0.45mg/mL、液体给药，20‑25℃条件下培养18‑32h，即获得秀丽隐杆线虫高尿酸模型；所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法，步骤如下：⑴利用高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量；⑵对步骤⑴的秀丽隐杆线虫分别采用固体给药和液体给药两种方式进行培养，通过比较两种给药方式对秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响，确定最佳的给药培养方式；⑶对步骤⑵所确定的最佳给药方式分别给予秀丽隐杆线虫次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤四种药物不同的浓度和不同的作用时间，以秀丽隐杆线虫为单位，测定秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定最佳的给药物质、给药剂量；所述不同的浓度为0，0.05，0.15，0.25，0.50，0.65mg/mL；所述不同的作用时间为0，6，10，18，24，32，48h；⑷在步骤⑶所确定的最佳给药物质和给药剂量条件下，测定最佳给药物质在不同给药时间对秀丽隐杆线虫平均寿命的影响并结合秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化，确定最佳给药物质的最佳给药时间；所述不同给药时间为0，18，24，32，48h；⑸确立秀丽隐杆线虫高尿酸模型构建方法，对由该构建方法所获得的高尿酸秀丽隐杆线虫模型进行系列实验评价，所述系列实验评价包括秀丽隐杆线虫运动能力变化评价、秀丽隐杆线虫产卵量变化评价、模型稳定性评价、别嘌呤醇药物评价、黄嘌呤氧化酶活性评价，确定高尿酸秀丽隐杆线虫模型构建方法的稳定性、可靠性以及对秀丽隐杆线虫的损伤性，确定最佳条件，即获得秀丽隐杆线虫高尿酸模型；所述步骤⑴中秀丽隐杆线虫测定前经乙腈除蛋白处理，且乙腈的加入量为：500条秀丽隐杆线虫加入乙腈5.0mL；或者，所述高效液相色谱法测定尿酸含量的条件如下：色谱柱：Intertsil ODS‑SP色谱柱，5μm，4.6mm×250mm；流动相：10mmol/L的乙酸铵；检测器：紫外检测器；柱温：25℃；流速：1mL/min；进样量：30μL；标准曲线绘制：准确称取4.0mg尿酸标准品，用质量百分数为25％的氨水超声溶解定容至10mL，得到浓度为400μg/mL的尿酸标准母液，配制成浓度为0，12.5，30，60，90，120，150μg/mL的尿酸标准溶液，过膜备用；准确进样30μL，根据峰面积与标准溶液进样浓度成正比的对应关系绘制尿酸标准曲线，求得回归方程、相关系数及其线性范围；或者，所述步骤⑵中固体给药的培养具体如下：秀丽隐杆线虫所用标准培养基为NGM培养基，其配制比例及程序为3g NaCl、17g琼脂、2.5g蛋白胨、1L双蒸水，高压蒸汽灭菌后，在无菌条件下加入1mL胆固醇的浓度为5mg/mL的胆固醇无水乙醇溶液、1mL浓度为1mol/L且经高压蒸汽灭菌的MgSO4溶液、1mL浓度为1mol/L且经高压蒸汽灭菌的CaCl2溶液和25mL的1mol/L、经高压蒸汽灭菌、pH＝6.0的磷酸钾缓冲液，充分混均，倒入直径为9cm的培养皿，冷却待用；其中，所述胆固醇无水乙醇溶液的制备过程为：胆固醇使用无水乙醇进行溶解且经0.45μm滤膜过滤除菌；线虫同期化，将孵化好的幼虫SM液体培养液1500‑2000r/min离心2‑5min收集幼虫，转到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基平板上，将平板置于20℃培养箱中继续培养，培养至32h后待用；不同浓度0，0.05，0.15，0.25，0.35mg/mL的药品次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤、培养基准备完毕后，吸取5mL药品，至一已灭菌的50mL离心管中，再倾倒NGM培养基至体积22.5mL，再倒入平板，待其凝固后进行下一步实验；每个药品的每个浓度三个平行，此过程需快速，以免培养基凝固；空白平板加入5mLM9缓冲液；平板中培养基凝固后，选择无气泡、表面光滑的平板，用移液枪吸取100μL大肠杆菌OP50于培养基上，并涂抹均匀，涂抹时菌液距离皿壁20mm，晾干待用；将已经培养32h后的线虫用M9缓冲液冲洗2‑3次后，定容，然后用移液枪吸取0.2‑2mL滴加在涂有OP50的NGM平板中央，将平板用封口膜密封，再用保鲜膜包裹好后放入20℃培养箱中培养24h；收集线虫，用M9缓冲液反复清洗2‑3次，保证所有线虫全部收集，定容至1mL，放入冰箱中或进行液相前处理；或者，所述步骤⑵中液体给药的培养具体如下：同期化后，将孵化好的幼虫SM液体培养液1500‑2000r/min离心2‑5min收集幼虫，转到涂有大肠杆菌OP50的NGM平板上，将平板置于20℃培养箱中继续培养，培养32h；将配制好的SM液体培养液，在无菌条件下分装入6孔培养板中，每孔3.6mL，再加入配制好的不同浓度0，0.05，0.15，0.25，0.35mg/mL的药品次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤，每孔1.2mL，每个药品每个浓度三个平行；通过显微镜观察，选择长势相同的平板用M9缓冲液冲洗干净，转至15mL离心管中，1500‑2000r/min离心2‑5min，吸取上清，并定容后摇匀分装入6孔培养板，使每孔含有虫体500±5条，用封口膜封好之后放于20℃培养箱分别培养至0，6，10，18，24，32h，然后用移液枪吸入15mL离心管中，1500‑2000r/min离心，然后定容至1mL，放入冰箱进行保存或进行液相前处理。