[发明专利]一种抗3型解脲支原体MB蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒

摘要

本发明涉及抗3型解脲支原体MB蛋白抗体及应用该抗体检测解脲支原体的免疫层析试剂盒，抗3型解脲支原体MB蛋白抗体是识别3型解脲支原体MB蛋白105‑118位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体，3型解脲支原体MB蛋白在GenBank序列号是AAC41437.1；3型解脲支原体MB蛋白105‑118位的氨基酸序列为KLPREPKPNEQLTI。本发明所提供的兔抗3型解脲支原体MB蛋白抗体具有特异性好、纯度高、效价高、制备成本低廉的特点。

主权项

1.一种基于抗3型解脲支原体MB蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒；抗3型解脲支原体MB蛋白抗体是AbMB3Linearar，AbMB3Linearar的制备方法是：1)经结构生物学分析及相关实验研究后，选定3型解脲支原体MB蛋白105‑118位的14个氨基酸作为制备兔抗3型解脲支原体MB蛋白抗体的线性抗原表位，该段氨基酸序为KLPREPKPNEQLTI,将此序列命名为MB3Linear；2)将步骤1)所述的氨基酸序列MB3Linear的C端添加一个半胱氨酸后，用多肽自动合成仪合成多肽并纯化，纯化后的多肽与载体蛋白KLH偶联，形成MB3Linear‑KLH复合蛋白；3)将步骤2)所合成的复合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多点注射，先后注射三次，每次间隔7‑10天；4)第三次注射10‑12天后，收集、分离得到含有兔抗3型解脲支原体MB蛋白单表位抗体的血清，ELISA检测血清中兔抗3型解脲支原体MB蛋白单表位抗体的效价，所述抗体的效价在1：60000以上；5)将步骤2)合成并纯化的多肽与溴化氰活化的Sepharose4B偶联，形成多肽亲和层析柱；6)将步骤4)获得的含有兔抗3型解脲支原体MB蛋白单表位抗体的血清加入到步骤5)制备的亲和层析柱中，并在4℃孵育过夜后，洗脱抗体，得到兔抗3型解脲支原体MB蛋白单表位抗体；经SDS‑PAGE鉴定其纯度在97％以上，将这种纯化的抗体命名为AbMB3Linear；所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：1)量子点标记抗体AbMB3Linearar：向微量离心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺EDC，以MES缓冲液定容为1ml，混合溶液，37℃反应5min后，再加入0.34mg的制备得到的抗体AbMB3Linearar，避光反应2h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000‑NH2至终浓度为1％m/v，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；反应后的样品用超滤管离心，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到上部清液以及下部沉淀，10000g条件下离心3min；将上部清液加到分离柱Superdex‑200上纯化，待上部清液自然流入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待样品开始从下部流出时开始收集，收集1ml后停止收集；将纯化后的样品用超滤管以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心除团聚，对普通EP管进行离心的条件是10000g，3min；获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍，4℃保存备用；至此制得含有量子点标记抗体AbMB3Linearar的溶液；所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66g/L MES以及0.74g/L EDTA，所述MES缓冲液的pH7.4；所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、1g牛血清白蛋白BSA以及0.1gNaN₃，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；2)制备结合垫将聚酯纤维膜浸入步骤1)所得到的含有量子点标记抗体AbMB3Linearar的溶液中1h，取出，25℃干燥后裁成后规格为4cm×0.6cm/条后，4℃密封保存备用，至此制得结合垫；3)制备样品垫取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成规格为4cm×2.5cm/条后，即制得样品垫，25℃密封保存；所述样品垫处理液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、2g牛血清白蛋白BSA、1ml吐温‑20、2g蔗糖以及0.5g聚乙烯吡咯烷酮PVP‑10，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；4)制备检测层4.1)抗MB蛋白多克隆抗体的制备：4.1.1)相关基因的克隆对3型解脲支原体MB蛋白进行生物信息学分析，获取3型解脲支原体MB蛋白N端胞外保守结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到该肽段对应的DNA编码序列，同时在此DNA编码序列的5’端引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后分别化学合成全基因序列，记为MB3；MB3基因编码的蛋白质序列为天然3型解脲支原体膜蛋白MB的30‑150aa；将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57分别用NdeI及XhoI进行双酶切后按常规方法分别回收目的片段，备用；同时采用NdeI及XhoI对载体pET‑28a(+)进行双酶切，并按常规方法分别将经双酶切后获得的MB3基因连入pET‑28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET‑MB3表达载体；经酶切和序列测定证实表达载体构建无误；该载体表达重组MB3‑His融合蛋白；4.1.2)重组MB3‑His融合蛋白的表达与纯化将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coli BL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株；挑取pET‑MB3转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中，于37℃培养过夜；取出菌液后，按1：100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达；诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体；将此菌体用20mL磷酸盐缓冲液洗涤3次并用10mL上样缓冲液重悬后进行超声破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次；超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测；发现重组蛋白MB3‑His以可溶性方式存在于菌体中；所述上样缓冲液中各组分含量分别是：20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl以及30mM咪唑；所述上样缓冲液的pH7.4；重组MB3‑His融合蛋白的纯化步骤如下：将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns，按照说明书用同样的方法进行纯化；具体方法如下：a)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上，以1mL/min流速洗柱；b)用10mL上样缓冲液平衡，1mL/min流速；c)将融合蛋白上样，1mL/min流速；d)用10mL上样缓冲液，以1mL/min流速洗柱；e)用10mL洗脱缓冲液，以1mL/min流速洗脱，分管收集，每管1ml，12％SDS‑PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品；经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL；所述洗脱缓冲液中各组分含量分别是：20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl以及300mM咪唑，所述洗脱缓冲液的pH7.4；4.1.3)抗MB蛋白多克隆抗体的制备用上述纯化的重组MB3‑His融合蛋白按照200μg与1mL弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫雄性新西兰大白兔，于背部皮下多点注射，间隔7d后再免疫一次，再过14d后用上述纯化的重组P1‑His融合蛋白按照200μg与1mL弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行加强免疫，加强免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次；7d后取血分析抗体滴度；直至抗体滴度用间接ELISA法测定抗体效价大于1×10⁵后心脏采血，分离血清，以Protein G亲和层析柱，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液调整为1mg/mL，‑20℃保藏备用，至此制得抗MB蛋白多克隆抗体；4.2)制备检测层将硝酸纤维素膜剪成4cm×4cm大小；将步骤4.1)制备得到的抗MB蛋白多克隆抗体和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.0mg/mL；将稀释好的抗MB蛋白多克隆抗体装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为0.7cm；将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2h，剪裁成4cm×4cm的规格，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；所述磷酸盐缓冲液的制备方式是：称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠以及0.2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；5)组装检测卡5.1)将底板裁剪成4cm×7.3cm大小，备用；5.2)将吸水滤纸裁剪成4cm×3cm大小，作为吸水垫，备用；5.3)将步骤5.1)制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4)所述的检测层即带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面；5.4)将步骤5.2)准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端有0.2cm的重叠，吸水垫的右边缘则与底板的右边缘对齐粘好并抹平；再将步骤2)所述的结合垫按0.3cm重叠于检测层的左边缘处，0.3cm粘于底板上；5.5)将步骤3)所述的样品垫则按一边0.3cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；将组装好的检测板于切条机下裁成4.0mm宽的检测卡，4℃密封干燥避光保存；所述试剂盒是基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：1)胶体金标记抗体AbMB3Linearar：1.1)制备30nm胶体金溶液：取一个硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超纯水，将1ml1％m/v HAuCl₄溶液加入250ml三角瓶中并与超纯水混匀，油浴加热并搅拌至沸腾；向250ml三角瓶中快速加入2ml1％m/v柠檬酸三钠水溶液，溶液继续沸腾10min，待250ml三角瓶中的溶液由蓝色转变为红色时停止加热，将250ml三角瓶中的溶液自然冷却至室温，然后向250ml三角瓶中加入超纯水补齐至100ml；1.2)胶体金标记抗体AbMB3Linear：1.2.1)取一个硅化好的50ml三角瓶，加入10ml步骤1.1)所制备的胶体金溶液，向胶体金液中加入240ul0.2mol/L K₂CO₃调节pH至8.5；1.2.2)在电磁搅拌器搅拌下，将抗体AbMB3Linear加入胶体金溶液中，至抗体终浓度为10ug/ml，加入抗体时逐滴加入，加完后继续搅拌45min～60min；1.2.3)反应完成加入5％m/v牛血清白蛋白BSA至终浓度为1％m/v，搅拌15～30分钟，4℃保存备用；1.2.4)将标记好的抗体AbMB3Linear取出后装入50ml离心管,2500g，4℃离心5分钟，得到下层沉淀及上层清液，弃掉下层沉淀，上层清液转移至另一只50ml离心管，12000g，4℃离心30分钟，得到下层沉淀及上层清液，弃掉上层清液，将下层沉淀用10ml胶体金缓冲液重悬沉淀，然后再12000g，4℃离心30分钟，再次得到下层沉淀及上层清液，将下层沉淀最后用3ml胶体金缓冲液重悬，4℃保存备用，得到含有胶体金标记抗体AbMB3Linear的溶液；所述胶体金缓冲液中各组分含量分别是：10mM Tris、1％m/vBSA、1％v/v Tween‑20、5％m/v蔗糖以及3‰m/v聚乙烯吡咯烷酮PVP‑10，所述胶体金缓冲液的pH为10.5；2)制备结合垫将聚酯纤维膜浸入步骤1)所得到的含有胶体金标记抗体AbMB3Linear的溶液中1h，取出，25℃干燥后裁成后规格为4cm×0.6cm/条后，4℃密封保存备用，至此制得结合垫；3)制备样品垫取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少2h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成规格为4cm×1.5cm/条后，即制得样品垫，25℃密封保存；所述样品垫处理液的制备方式是称取0.242g Tris、1g牛血清白蛋白BSA、1ml吐温‑20、5g蔗糖以及0.3g聚乙烯吡咯烷酮PVP‑10，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至11后用去离子水定容至100ml；4)制备检测层4.1)抗MB蛋白多克隆抗体的制备：4.1.1)相关基因的克隆对3型解脲支原体MB蛋白进行生物信息学分析，获取3型解脲支原体MB蛋白N端胞外保守结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到该肽段对应的DNA编码序列，同时在此DNA编码序列的5’端引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后分别化学合成全基因序列，记为MB3；MB3基因编码的蛋白质序列为天然3型解脲支原体膜蛋白MB的30‑150aa；其蛋白质全序列如序列表所示；将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57分别用NdeI及XhoI进行双酶切后按常规方法分别回收目的片段，备用；同时采用NdeI及XhoI对载体pET‑28a(+)进行双酶切，并按常规方法分别将经双酶切后获得的MB3基因连入pET‑28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET‑MB3表达载体；经酶切和序列测定证实表达载体构建无误；该载体表达重组MB3‑His融合蛋白；4.1.2)重组MB3‑His融合蛋白的表达与纯化将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coli BL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株；挑取pET‑MB3转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中，于37℃培养过夜；取出菌液后，按1：100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达；诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体；将此菌体用20mL磷酸盐缓冲液洗涤3次并用10mL上样缓冲液重悬后进行超声破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次；超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测；发现重组蛋白MB3‑His以可溶性方式存在于菌体中；所述上样缓冲液中各组分含量分别是：20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl以及30mM咪唑；所述上样缓冲液的pH7.4；重组MB3‑His融合蛋白的纯化步骤如下：将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns，按照说明书用同样的方法进行纯化；具体方法如下：a)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上，以1mL/min流速洗柱；b)用10mL上样缓冲液平衡，1mL/min流速；c)将融合蛋白上样，1mL/min流速；d)用10mL上样缓冲液，以1mL/min流速洗柱；e)用10mL洗脱缓冲液，以1mL/min流速洗脱，分管收集，每管1ml，12％SDS‑PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品；经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL；所述洗脱缓冲液中各组分含量分别是：20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl以及300mM咪唑，所述洗脱缓冲液的pH7.4；4.1.3)抗MB蛋白多克隆抗体的制备用上述纯化的重组MB3‑His融合蛋白按照200μg与1mL弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫雄性新西兰大白兔，于背部皮下多点注射，间隔7d后再免疫一次，再过14d后用上述纯化的重组P1‑His融合蛋白按照200μg与1mL弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行加强免疫，加强免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次；7d后取血分析抗体滴度；直至抗体滴度用间接ELISA法测定抗体效价大于1×10⁵后心脏采血，分离血清，以Protein G亲和层析柱，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液调整为1mg/mL，‑20℃保藏备用，至此制得抗MB蛋白多克隆抗体；4.2)制备检测层将硝酸纤维素膜剪成4cm×4cm大小；将步骤4.1)制备得到的抗MB蛋白多克隆抗体和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.0mg/mL；将稀释好的抗MB蛋白多克隆抗体装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为0.7cm；将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2h，剪裁成4cm×4cm的规格，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；所述磷酸盐缓冲液的制备方式是：称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠以及0.2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；5)组装检测卡5.1)将底板裁剪成4cm×6cm大小，备用；5.2)将吸水滤纸裁剪成4cm×2.5cm大小，作为吸水垫，备用；5.3)将步骤5.1)制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4)所述的检测层即带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面；5.4)将步骤5.2)准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端有0.2cm的重叠，吸水垫的右边缘则与底板的右边缘对齐粘好并抹平；再将步骤2)所述的结合垫按0.2cm重叠于检测层的左边缘处，0.4cm粘于底板上；5.5)将步骤3)所述的样品垫则按一边0.2cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；将组装好的检测板于切条机下裁成4.0mm宽的检测卡，4℃密封干燥避光保存。