[发明专利]一种赖氨酰肽链内肽酶的原核重组表达与制备方法

摘要

本发明公开了一种赖氨酰肽链内肽酶的原核重组表达与制备方法。该制备方法包括：向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列为序列2的重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞；对其进行诱导表达，收集并破碎重组大肠杆菌细胞，得到包含体；然后依次进行变性、复性、激活、纯化，得到重组赖氨酰肽链内肽酶。采用本发明的制备方法制备的重组Lys‑C蛋白酶具有高的酶活力和较高的尿素耐受。本发明的制备方法具有酶、特异性好、无动物来源病毒等有优点，生产与制备工艺简单、成本低，可以应用于生物制药和蛋白质组学研究。

主权项

1.一种制备重组赖氨酰肽链内肽酶的方法，包括如下步骤：（1）向受体大肠杆菌细胞中导入氨基酸序列如序列表中序列2所示的重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞；所述重组赖氨酰肽链内肽酶的编码基因是通过重组表达载体的形式导入所述受体大肠杆菌细胞中的；所述重组表达载体为将序列表中序列1的第502‑1818位所示DNA片段替换pET‑32a(+)载体的酶切位点EcoR I和Xho I的识别序列间的DNA片段后得到的重组质粒；（2）对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达后，收集所述重组大肠杆菌细胞；破碎所述重组大肠杆菌细胞，得到包含体；（3）对所述包含体进行变性，得到变性后的样品；（4）将所述变性后的样品进行复性，得到复性后的样品；（5）将所述复性后的样品进行激活，得到有活性的重组赖氨酰肽链内肽酶粗品；（6）对所述重组赖氨酰肽链内肽酶粗品进行纯化，得到纯化后的重组赖氨酰肽链内肽酶；在步骤（4）中，所述复性在复性缓冲液中进行，所述复性缓冲液的pH值为10.0，所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、胱氨酸、半胱氨酸和尿素；所述三羟甲基氨基甲烷在所述复性缓冲液中的浓度为20mM，所述胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为1mM，所述半胱氨酸在所述复性缓冲液中的浓度为3mM，所述尿素在所述复性缓冲液中的浓度为2M；在步骤（5）中，所述激活为将所述复性后的样品调pH值为7.5，于25℃静置6小时；在步骤（6）中，所述纯化为将所述重组赖氨酰肽链内肽酶粗品依次进行硫酸铵沉淀、金属离子亲和层析、超滤浓缩和凝胶过滤层析；所述金属离子亲和层析采用的层析介质为金属螯合高流速琼脂糖微球或者金属螯合高分辨琼脂糖微球；所述凝胶过滤层析采用的层析介质为丙烯葡萄糖凝胶S‑100；所述金属离子亲和层析的洗脱程序如下：1）用平衡液与洗脱缓冲液的混合液进行咪唑线性洗脱，共洗脱5个柱体积，在所述5个柱体积内，咪唑在所述混合液中的浓度由0M线性升至0.01M；2）用所述平衡液与所述洗脱缓冲液的混合液进行咪唑线性洗脱，共洗脱10个柱体积，在所述10个柱体积内，咪唑在所述混合液中的浓度由0.01M线性升至0.5M；所述平衡液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和NaCl，所述三羟甲基氨基甲烷在所述平衡液中的浓度为20 mM Tris，所述NaCl在所述平衡液中的浓度为2 M，所述平衡液的pH值为7.5；所述洗脱缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、NaCl和咪唑，所述三羟甲基氨基甲烷在所述洗脱缓冲液中的浓度为20 mM Tris，所述NaCl在所述洗脱缓冲液中的浓度为2 M，所述咪唑在所述洗脱缓冲液中的浓度为0.5 M咪唑，所述洗脱缓冲液的pH值为7.5。