[发明专利]基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法

摘要

本发明提供一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，包括以Fe3O4纳米颗粒为固相载体，制备出表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的免疫磁性颗粒，将DNMT1标准品或待测样品采用所述免疫磁性颗粒捕获并富集分离，然后向分离后所得的产物中加入被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，使抗体与待测抗原结合，采用多功能微孔板读数仪以270 nm激发下进行荧光检测，根据荧光强度与DNMT1标准品或待测样品浓度的关系建立回归方程。该方法步骤简单且由该方法建立的回归方程对DNMT1检测的线性范围宽、检测限低、精密度、准确度高且具有良好的特异性。

主权项

一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，具体步骤包括：按照下述步骤提供一种表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的Fe3O4纳米免疫磁性颗粒，记为Fe3O4@McAb：清洗：将Fe3O4纳米颗粒悬浮液经超声、磁分离弃上清处理后，采用浓度为0.01 mol/L～0.015 mol/L、pH为6.0的MES缓冲液对其平衡2min～5 min，然后进行磁分离、弃上清处理得到第一沉淀物；活化：向所述第一沉淀物中依次加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL的EDC溶液和浓度为8 mg/mL～11 mg/mL的NHS溶液进行涡旋反应10 min～15 min，经磁分离、弃上清处理后，采用MES缓冲液对其洗涤3～4次，然后再进行磁分离、弃上清处理得到第二沉淀物；缓冲体系转换：采用PBS缓冲液对所述第二沉淀物洗涤3～4次次，磁分离得到第三沉淀物；偶联：向所述第三沉淀物中加入DNMT1单克隆抗体和PBS缓冲液进行涡旋反应1.5 h～2 h，经磁分离、弃上清处理后采用PBS缓冲液对其清洗2次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物；封闭：向所述第四沉淀物中加入BSA封闭液，进行涡旋反应0.5 h～1 h，磁分离、弃上清处理后，采用PBST缓冲液清洗3～4次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物即Fe3O4@McAb；保存：在Fe3O4@McAb中加入PBS缓冲液，轻晃摇匀，4℃保存备用；按照下述步骤提供一种表面被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，记为QDs@PcAb：将pH为7.0～7.4的硼酸盐缓冲液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入浓度为0.5 微摩尔每升～1 微摩尔每升的QDs和浓度为0.5 mg/mL～1 mg/mL的DNMT1多克隆抗体，每次加入上述物质后均需振荡混匀；然后向所述PE管中加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL的EDC溶液，在18℃～25℃下涡旋反应1.5 h～2 h，反应结束后向所述PE管中加入含质量百分数为0.5%～1.0%的BSA封闭液的PBS缓冲液，在18℃～25℃下涡旋反应20 min～30 min；所得反应产物经离心、超滤除去EDC后溶于BS缓冲液中，4℃保存，从而制得QDs@PcAb；将经CB缓冲液稀释后的所述Fe3O4@McAb与经PBS缓冲液稀释后的DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应50 min～60 min，使得所述DNMT1标准样或待测目标物被Fe3O4@McAb捕获、富集分离；然后将经PBST缓冲液稀释后的所述QDs@PcAb与被Fe3O4@McAb捕获、富集分离的所述DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应110 min～130 min，使得所述QDs@PcAb与所述DNMT1标准样或待测目标物相结合；经PBST缓冲液稀释后，在多功能微孔板读数仪上测定270 nm激发下反应产物的荧光强度；根据检测的荧光强度与所述DNMT1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测DNMT1的回归方程；其中，在所述DNMT1标准品浓度为5.0 ng/mL～1500 ng/mL范围内，所建立的回归方程为Y=0.00775X+20.77161，其中，Y代表荧光值RFU，X为DNMT1标准品浓度，相关系数r为0.9873；在所述DNMT1标准品浓度为0.1 ng/mL～5.0 ng/mL范围内，本方法检测DNMT1的回归方程为Y=0.02779X+1.29858，其中Y代表lgRFU，X代表lgDNMT1，相关系数r为0.9877。