[发明专利]全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法

摘要

本发明提供全悬浮培养型Marc‑145细胞系的驯化方法，步骤如下：（1）贴壁培养型Marc‑145细胞的培养；（2）低血清贴壁培养型Marc‑145细胞系的驯化；（3）低血清全悬浮培养型Marc‑145细胞的驯化；（4）无血清全悬浮培养型Marc‑145细胞的驯化。应用本发明的细胞驯化方法能够得到悬浮培养的Marc‑145细胞，该细胞适应低血清和无血清全悬浮培养，在7.5L的反应器按无血清培养密度可达8×106/ml，至少可得到4.4×1010的细胞，相当于80‑90个15L滚瓶或18‑20个40层细胞工厂收获的细胞数量，发明效果明显。

主权项

全悬浮培养型Marc‑145细胞系的驯化方法，其特征在于：步骤如下：（1）贴壁培养型Marc‑145细胞的培养选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，对PRRSV敏感的贴壁培养型Marc‑145细胞，待细胞生长致密单层后用含10%新生牛血清的DMEM培养液按1：4比例分瓶传代，置37℃ 5% CO₂的培养箱培养，在48‑72h内细胞形成致密单层，为边缘清晰的扁平上皮型细胞且细胞生长正常的情况下可用于驯化；（2）低血清贴壁培养型Marc‑145细胞系的驯化a)将步骤（1）所述生长正常的贴壁培养型Marc‑145细胞分别用含新生牛血清8%、5%的DMEM培养液各培养三代；每次传代的标准是按1：4比例分瓶，在37℃5%CO₂培养，在48‑72h内细胞形成致密单层；b)将培养液换成DMEM/F12后加5%新生牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a)；c)培养液中新生牛血清降为3%，按b步骤中的方法，传代比例降为 1：3再培养三代；d）培养液中新生牛血清降为1%，在培养液中再加体积百分含量20%上一代次培养了该细胞48‑72h的培养液继续培养五代，传代标准同步骤c)；细胞在48h‑72h内形成致密单层，驯化得到了低血清贴壁培养型Marc‑145细胞系；（3）低血清全悬浮培养型Marc‑145细胞的驯化a)将步骤（2）驯化的低血清贴壁培养型Marc‑145细胞，用DMEM/F12和无血清培养基1号按体积比1：1比例混合后，加3‑5%新生牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至3‑5×10⁵/ml，100‑130r/min、37℃ 5% CO₂摇床培养；b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1×10⁶/ml时，800‑1000r/min离心后换用新鲜培养液重新悬浮培养；细胞密度达到1×10⁶/ml时，800‑1000r/min离心按1：2比例分瓶培养；至细胞密度达到2×10⁶/ml时，800‑1000r/min离心按1：3比例分瓶培养；在连续三代按1：3比例培养48h细胞密度均达2×10⁶/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型Marc‑145细胞系；（4）无血清全悬浮培养型Marc‑145细胞的驯化a) 在无血清培养基2号中加3%新生牛血清，将步骤（3）中得到的低血清全悬浮培养型Marc‑145细胞直接稀释到密度5‑7×10⁵/ml，置100‑130r/min、37℃5%CO₂摇床培养；b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3×10⁶/ml时，将细胞悬液直接稀释至5×10⁵/ml接种培养，每培养一代新生牛血清浓度下降1%，到第4代时血清降为0，完全用无血清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达3×10⁶/ml时，驯化得到无血清全悬浮培养型Marc‑145细胞系。