[发明专利]一种应用新型细胞微载体增殖水貂犬瘟热病毒的方法

摘要

本发明专利公开了一种应用新型细胞微载体增殖水貂犬瘟热病毒的方法，通过应用新型微载体和大规模高密度细胞悬浮培养技术实现水貂犬瘟热病毒高效增殖，本发明具有细胞密度大、病毒滴度高、生产效率高、过程可控性强和产品质量均一稳定等优点，克服了传统转瓶生产工艺的产品批间差大、抗原含量低和生产效率低等诸多不足。

主权项

一种应用新型细胞微载体增殖水貂犬瘟热病毒(CDV)的方法，其特征在于：包括以下步骤：A)用Flask细胞培养瓶和3L转瓶逐级放大培养Vero或DF1细胞，当转瓶细胞数量达到所需要求时，无菌收集转瓶细胞作为种子细胞。b)选择新型Cephodex细胞培养微载体为细胞贴附生长的载体。按10g/L的用量，根据培养体积称取一定量的Cephodex微载体放入PBS中，用玻璃棒充分搅拌，使微载体于PBS中分散混悬。c)将混悬好的微载体注入反应器中，安装完好后将罐体置于121℃高压蒸汽灭菌30min，待温度降至80℃后，以底部通气模式向罐体内以100cc/min的流量持续通气空气，开启搅拌桨，并以95rpm的速率连续搅拌，罐体温度设为37℃，静置24小时后，校正DO数据，向反应器中加入少量细胞生长液37℃孵育24‑72h进行无菌检验。d)将收集好的种子细胞按3×10⁵cells/ML的密度接种接种入反应器罐体内并与微载体充分混悬。而后每搅拌2～3min，静置30‑60min，持续6‑8h，然后以能使微载体悬浮的最小搅拌速度连续搅拌培养。e)细胞反应器内培养约72h，取样观察细胞生长状态，待细胞在微载体上汇合度达90％以上，且通过测定细胞糖耗水平，确定细胞密度达到最大，按M.O.I约为0.05接种入CDV病毒悬液。f)接种病毒8h后将培养温度降至36℃。24h后每8～24h取样显微镜观察和培养液测糖含量，待微载体上的细胞80％脱落，细胞糖耗接近0时，停止搅拌，沉降微载体，收获上清。