[发明专利]一种胃蛋白酶原Ⅰ或Ⅱ测定试剂盒及其制备方法

摘要

本发明提供一种胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ测定试剂盒，包括测PG Ⅰ/Ⅱ磁微粒、测PG Ⅰ/Ⅱ示踪结合物和PG Ⅰ/Ⅱ校准品，测PG Ⅰ/Ⅱ磁微粒为标记有胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ单克隆抗体的磁性微球和磁微粒保存液；测PG Ⅰ/Ⅱ示踪结合物为标记有胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ抗体的示踪标记物和示踪结合物稀释液，所述示踪标记物为吖啶酯及其衍生物；PG Ⅰ/Ⅱ校准品包括胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ溶液，用于测定仪内储存主曲线的校正。本发明在酶免疫分析基础上结合高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，用顺磁性微粒作为固相载体，由于颗粒体积小，表面积大，扩大了反应面积，大大提高了灵敏度，使用全自动仪器及配套试剂，使人为因素减至最低，提高了方法的稳定性和结果的重复性，同时也使得批内差异与批间差异都较小。

主权项

1.一种胃蛋白酶原I/II测定试剂盒，包括测PG I/II磁微粒、测PG I/II示踪结合物和PG I/II校准品，其特征在于：所述测PG I/II磁微粒为标记有胃蛋白酶原I/II单克隆抗体的磁性微球和磁微粒保存液；测PG I/II示踪结合物为标记有胃蛋白酶原I/II抗体的示踪标记物和示踪结合物稀释液，所述示踪标记物为吖啶酯及其衍生物；PG I/II校准品包括胃蛋白酶原I/II溶液，用于测定仪内储存主曲线的校正，所述胃蛋白酶原I/II测定试剂盒的制备方法，具体步骤如下：1)测PG I/II磁微粒的制备，包括磁微粒保存液的配制和磁微粒标记PG I/II抗体的制备；2)测PG I/II示踪结合物的制备，包括示踪物稀释液的配制和吖啶酯标记PG I/II抗体的制备；3)PG I/II校准品的制备，包括校准品稀释液的配制和校准品的配制；所述步骤1)中磁微粒保存液的配制包括如下步骤：1.1称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适量的纯化水搅拌使其完全溶解；1.2用移液器移取1mL proclin 300于10mL纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述1L的容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀；1.3调节PH计测量溶液PH，使其控制在7.2‑7.4之间；1.4称取酪蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；1.5定容至1L，用0.2μm滤器过滤，过滤后贴好标签于2‑8℃无菌环境下贮存；所述步骤1)中磁微粒标记PG I/II抗体的制备包括如下步骤：1.6将带羧基的磁微粒与碳二亚胺(EDC)分别按质量比1∶1‑3的比例混合；1.7按每毫克磁微粒分别加入5‑40μg抗体的比例加入PG I/II单抗，磁微粒与抗体质量比为100∶1；1.8在混匀情况下20‑28℃分别标记0.5‑2小时；1.9标记后采用终浓度25mM的甘氨酸封闭多余的位点，22‑26℃反应0.5小时，至少洗涤三次，用磁微粒保存液进行保存；1.10采用方阵滴定法调试最佳浓度，用磁微粒保存液按照最佳浓度稀释磁微粒标记PG I/II得到测PG I/II磁微粒，于2‑8℃贮存；所述步骤2)中示踪物稀释液的配制包括如下步骤：2.1称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适量的纯化水搅拌，用移液器移取1mL Tween‑20搅拌使其完全溶解；2.2用移液器移取1mL proclin 300于10mL纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述1L的容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀；2.3调节PH计测量溶液PH，使其PH控制在7.2‑7.4之间；2.4称取酪蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；2.5定容至1L，用0.2μm滤器过滤，过滤后贴好标签于2‑8℃无菌环境下贮存；所述步骤2)中吖啶酯标记PG I/II抗体的制备包括如下步骤：2.6分别取10molPG I/II单抗，按照每10mol抗体分别加入吖啶酯25‑200mol标记；2.7戊二醛使用浓度分别为0.75‑1.5％，分别在20‑28℃反应0.5‑2小时；2.8用pH 7.2‑7.4的0.01M PBS透析，至少换液三次，透析后加入等体积甘油‑20℃存放；2.9采用方阵滴定法确定吖啶酯标记PG I/II抗体的最适工作浓度，用示踪结合物稀释液进行稀释，混匀即得到测PG I/II示踪结合物，置2‑8℃存放；所述步骤3)中校准品稀释液的配制包括如下步骤：3.1称取磷酸氢二钠2.68g，磷酸二氢钠0.39g，氯化钠8.5g于1L的容器中，加入适量的纯化水搅拌，用移液器移取1mL Tween‑20搅拌使其完全溶解；3.2用移液器移取1mL proclin 300于10mL纯化水的烧杯中，完全溶解后倒入上述1L的容器中，加入纯化水至900mL并充分搅拌均匀；3.3调节PH计测量溶液PH，使其PH控制在7.2‑7.4之间；3.4称取牛血清白蛋白10g加入上述1L容器中，搅拌均匀，使其充分溶解；3.5定容至1L，用0.2μm滤器过滤，过滤后贴好标签于2‑8℃无菌环境下贮存。所述步骤3)中校准品的配制包括如下步骤：3.6用校准品稀释液稀释PG I纯品的工作浓度范围为0.5‑500ng/mL；3.7稀释PGII纯品的工作浓度范围为0.1‑100ng/mL，配成PG I/II校准品1和PG I/II校准品2，校准品测定值应在范围之内，PG I校准品1的浓度范围为47.832‑60.833ng/mL，PG I校准品2的浓度范围为：291.300‑365.103ng/mL；PG II校准品1的浓度范围为：8.788‑11.018ng/mL，PG II校准品2的浓度范围为：53.289‑67.494ng/mL。