[发明专利]一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法

摘要

本发明涉及一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，属于动物外周血白细胞分离和培养领域。其包括动物强化培养、血液收集、白细胞分离和培养等步骤：按照常规方法在无菌环境中抽取一定量鱼血，然后采用Percoll梯度离心的方法分离血液中外周白细胞，将所得细胞进行洗涤纯化，并放在适宜温度中进行培养；所述步骤中，以改良的RPMI‑1640培养液作为培养基，配置不同浓度的Percoll分离液，细胞在培养温度27℃、95%湿度、5%CO₂环境中进行原代培养2h以上即可贴壁生长。采用本发明能够获得团头魴生长良好的外周血白细胞。

主权项

1.一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，其特征是步骤如下：（1）强化培养：选取体质健康，体表无伤，体重100‑250g的团头鲂，消毒后饲养于循环水系统中，每天3次投喂常规饲料15‑20天；（2）血液采集：随机抽取经过强化培养的团头鲂进行麻醉，并用酒精棉球擦拭鱼体，进行尾静脉抽血；全血与含2000‑3000U 肝素钠Heparin的RPMI‑1640培养基稀释后备用；（3）制备分离液：取若干已灭菌的15mL离心管，用过滤除菌的胎牛血清FBS润湿，依次用注射器小心加入3‑5 mL 质量浓度45%‑60%的硅胶颗粒混悬液Percoll和3‑4 mL质量浓度10%‑40%的Percoll溶液，保持界面清晰；（4）分离纯化：取步骤（2）所得稀释液1‑3mL，缓慢加到步骤（3）所得分离液上，在4‑10℃，400‑450g离心20‑30min，然后小心从离心机中取出；用1mL注射器或移液枪收集在Percoll梯度界面1/3处的细胞，将收集的白细胞放入新的离心管中，重悬细胞；然后在4‑10℃，400‑600g离心 5‑15min，倒掉上清，试管底部白色沉淀即为外周血白细胞，重复洗涤2‑3次；（5）原代培养：用RPMI‑1640培养基重悬步骤（4）洗涤后的外周血白细胞，用移液管小心将细胞悬液转移到已灭菌的10mL的培养瓶中，其中含有3‑4mL RPMI‑1640培养基，并在27℃、95%湿度、5% CO₂环境进行培养2‑4 h，即得所需贴壁的团头鲂外周血白细胞;步骤（1）所述健康团头鲂要进行强化培养，具体培养方法如下：选取体质健康，体表无伤，体重100‑250g的团头鲂，消毒后饲养于循环水系统中；所述养殖水恒温27℃，pH为7.2‑7.8，溶解氧>5mg/L，氨氮<0.01mg/L；每天3次投喂常规饲料，饲养15‑20天;步骤（2）血液采集具体如下：随机抽取健康团头鲂用MS‑222进行麻醉，后用质量浓度为75%的酒精棉球擦拭鱼体，置超净工作台中的托盘上，用2mL无菌注射器进行尾静脉抽血；按照全血与RPMI‑1640培养基质量比为1‑2：1‑3的比例稀释，备用。