[发明专利]一种快速制备叶绿素和叶绿素降解产物的方法

摘要

本发明公开了一种快速制备高纯度叶绿素和叶绿素降解产物的方法。本发明首次采用温州蜜柑果皮和甘薯叶片为原料来制备叶绿素及其衍生物，提供的方法不仅取材方便、快速、成本低，而且易操作，可以在三天内完成全部8种产物的制备，所得产品纯度可以达到90%‑95%，成本远远低于同种进口标准品的价格。本方法可以高效快速制备实验所需毫克级的叶绿素及其衍生物的标准对照品，适合在商业实验室及企业推广使用，具有广泛的应用前景。

主权项

1.一种快速制备脱植基叶绿素a和脱植基叶绿素b的方法，包括：(1)材料准备：新鲜蔬菜叶片和新鲜柑橘果实洗净晾干，将新鲜柑橘自果皮表层削取的0.2～0.3mm厚度的表皮，作为新鲜柑橘果皮，备用；(2)总叶绿素的提取，以下步骤在避光条件下进行：a.将(1)中洗净晾干的蔬菜叶片称取100g，用液氮冷冻，在研钵或样品破碎仪中磨成细粉；b.将样品粉末与提取液按1g:2mL的比例混合；超声清洗仪100％功率，冰浴超声20min～30min，期间上下混匀样品数次；4000g～5000g离心5min～10min，取上清；沉淀按上述样品粉末与提取液的比例重新加入提取液抽提；重复冰浴超声、离心和取上清过程，直至残渣无色，将收集的上清合并；所述的提取液为：N,N‑二甲基甲酰胺溶液，含0.1％碳酸镁，w/v；c.合并的上清分装至250mL分液漏斗中，每个分液漏斗100mL，按1:1的体积比加入正己烷混合，充分振荡后静置至完全分层；弃上层正己烷相，下层放入新的分液漏斗中，按上述上清与正己烷的体积比重新加入正己烷，继续振荡后静置分层，弃上层正己烷相，重复该步骤至上层无色，合并下层液；d.下层液与正己烷按4:1的体积比混合，剧烈振荡后‑20℃冰箱中放置2～3h；4000g～5000g离心10min～15min，移除最上层白色乳油状物及中间层正己烷相；按下层液和正己烷1:1的体积比继续加入正己烷，剧烈振荡后4000g～5000g离心10min，移除上层，重复该步骤至上层无色，移除上层保留下层液；e.下层液与10％氯化钠水溶液按体积比1:5～6混合，振荡1min，4000g～5000g离心5min，收集上清；剩余下层继续与无水乙醚按10:1的体积比混合，振荡1min，静置至分层，收集上清，重复该步骤一遍，将收集的上清合并；加入等体积的1:1,v/v的正己烷:无水乙醚溶液混合后，再加入5倍体积的10％氯化钠水溶液，振荡1min，静置至分层，合并收集的上清；加入与上清等体积的正己烷，振荡后加入无水硫酸钠至无结块；上清在避光条件下30℃真空浓缩仪中干燥或者氮气吹干，样品用锡箔纸包裹避光，冰箱中‑80℃长期保存或者‑20℃短期保存，得叶绿素粗提干燥物；(3)叶绿素a和叶绿素b的分离：称取步骤(2)中所得总叶绿素粗提干燥物10mg，用1:1,v/v的甲醇：丙酮溶解，配成终浓度2mg/mL，8000g～12000g离心10min～15min，上清经0.22μm微孔滤膜过滤后分装至2mL上样瓶中；按常规方式的液相色谱分离法进行叶绿素a和叶绿素b的分离；(4)脱植基叶绿素a和脱植基叶绿素b的制备(a)粗酶提取液的准备：称取步骤(1)中的新鲜柑橘果皮100g，液氮冷冻后，在研钵或样品破碎仪中磨成细粉末；每克样品粉末中加入1mL‑20℃预冷的丙酮，混匀后，超声清洗仪100％功率，冰浴超声10min～15min；4000g～5000g离心5min～10min，弃上清，沉淀继续加入100mL‑20℃预冷的丙酮，重复上述冰浴超声、离心、弃上清的过程2～3遍；弃上清后，沉淀在牛皮纸上摊开，通风橱中吹5min至干后倒入研钵，加入液氮，研磨成细粉；沉淀继续加入50mL‑20℃预冷的丙酮，超声清洗仪100％功率，冰浴超声10min～15min，4000g～5000g离心5min～10min，弃上清，重复上述冰浴超声、离心和弃上清的过程3～4遍至沉淀完全无色；每100g新鲜柑橘果皮得到的无色沉淀加入50mL缓冲液，充分搅匀所得悬浊液即为1份粗酶提取液；所述的缓冲液为：丙酮：0.2M Tris‑HCl＝1:1，v/v，其中0.2M Tris‑HCl的PH为8.0；(b)脱植基叶绿素a的制备：称取5mg步骤(3)中分离干燥所得的叶绿素a，无水乙醚溶解配制成500μg/mL，加入1份粗酶提取液混合，用缓冲液补足至100mL；水浴锅中42℃反应2h，期间振荡样品数次或者磁力搅拌器上42℃恒温搅拌反应2h；4000g～5000g离心10min，收集上清；避光条件下，30℃真空浓缩仪中干燥或者常温下氮气吹干，样品用锡箔纸包裹避光，冰箱中‑80℃长期保存或者‑20℃短期保存；(c)脱植基叶绿素b的制备：称取5mg步骤(3)中分离干燥所得的叶绿素b，后续操作同(b)中所述步骤，样品用锡箔纸包裹避光，冰箱中‑80℃长期保存或者‑20℃短期保存。