[发明专利]一种利用生物反应器规模化生产轮状病毒疫苗的方法

摘要

本发明涉及一种利用生物反应器规模化生产轮状病毒疫苗的方法，具体涉及一种用75L生物反应器大规模培养轮状病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：1)Vero细胞的复苏与传代，2)细胞收集与接种生物反应器，3)细胞的生物反应器培养，4)换液与细胞的洗涤，5)轮状病毒的活化及感染，6)轮状病毒的维持培养及收获；本发明的一个目的在于解决大规模生产中轮状病毒不易释放出细胞导致获得的病毒毒力滴度低的缺陷，获得了高滴度、高产量的灭活轮状病毒疫苗，本发明的另一个目的在于解决大生产过程中轮状病毒的吸附感染力度低的缺陷，从而极大地提高了轮状病毒的产量和质量。

主权项

1.一种利用生物反应器规模化生产轮状病毒疫苗的方法，包括以下步骤：1)Vero细胞的复苏与传代：将Vero细胞加入细胞生长液后放入到CO₂培养箱中培养，细胞长成单层后，消化贴壁细胞，并制成均匀的细胞悬液，分种于培养瓶中，加入细胞生长液继续培养，细胞这样传代2次后，消化收集培养瓶中的细胞，并接种于10层细胞工厂，然后加入细胞生长液继续培养；2)细胞收集与接种生物反应器：当细胞工厂中的细胞长满单层后，对每个细胞工厂的贴壁细胞用消化液进行消化，并将细胞收集到接种瓶中，从瓶中取样计数细胞，然后将细胞接种于事先加入生长液和载体的75L的生物反应器中；3)细胞的生物反应器培养：细胞接种后，采用灌流的方式加进细胞生长液和排除细胞培养废液，并且每天从反应器中取样计数细胞，细胞生长液是含有6％牛血清蛋白的M199培养液；4)换液与细胞的洗涤：当细胞达到5.0～6.0×10⁶cells/ml时，更换生物反应器的进液，即由不含牛血清的细胞维持液更换含有牛血清的细胞生长液，继续灌流培养，所述的不含牛血清的细胞维持液组成成分为含有0.5μg/ml胰蛋白酶的M199培养液，所述的灌流培养的灌流速度为6～8WV/D；5)轮状病毒的活化及感染：生物反应器中换为细胞维持液后24小时，调整生物反应器的控制条件，维持3～5小时后，取样计数细胞，并将MOI值控制在0.05～0.5接种活化后的轮状病毒种子，所述的生物反应器的控制条件为：温度35.0～36.0℃，pH值7.2～7.5，溶氧15％～35％；6)轮状病毒的维持培养及收获：毒种接种后采用连续灌流的方式进行培养，所述的生物反应器的培养条件为：温度：36.4～36.8℃，pH：7.2～7.5，溶氧：25％～45％，采用连续灌流的灌流速度为0.5～1.5WV/D，每天从反应器中取样并用胶体金试纸卡检测，检测卡样品条带颜色深浅与阳性条带相同，开始连续收获病毒液，检测卡样品条带颜色深浅度低于阳性条带颜色深浅度，停止收获病毒液。