[发明专利]一种里氏木霉重组t-PA的分离纯化方法有效
| 申请号： | 201610343132.3 | 申请日： | 2016-05-23 |
| 公开（公告）号： | CN105754976B | 公开（公告）日： | 2020-01-03 |
| 发明（设计）人： | 邵金华 | 申请（专利权）人： | 湖南科技学院 |
| 主分类号： | C12N9/58 | 分类号： | C12N9/58;C12R1/885 |
| 代理公司： | 11371 北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 李进 |
| 地址： | 425000 湖南*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | 本发明涉及t‑PA的分离纯化领域，特别涉及一种里氏木霉重组t‑PA的分离纯化方法：将里氏木霉发酵制得的含有t‑PA的粗酶液预处理后；采用D296强阴离子交换树脂柱进行脱色，脱色后用磷酸缓冲液洗脱，得到的洗脱液采用硫酸铵进行盐析，得到沉淀；将沉淀用磷酸缓冲液溶解，透析脱盐；脱盐后的酶液采用Q‑Sepharose High Performance强离子交换色谱进行分离纯化，梯度洗脱收集得到活性组分液；经冷冻抽干即得t‑PA成品。整个方法简单易行，得到的t‑PA A分子质量约为65000，等电点约为4.24，比活力达3200U/mg以上，纯化倍数为51.5以上，回收率为75％以上。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 里氏 重组 pa 分离 纯化 方法 | ||
【主权项】：
1.一种里氏木霉重组t-PA的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n将里氏木霉发酵制得的含有t-PA的粗酶液预处理后得到澄清液；/n所述澄清液采用D296强阴离子交换树脂柱进行脱色，脱色后用磷酸缓冲液洗脱，得到洗脱液；所述D296强阴离子交换树脂柱的直径为1.5±0.2cm，长度为30±1cm；所述澄清液在D296强阴离子交换树脂柱中的线速度小于 0.5cm/min；/n所述洗脱液采用硫酸铵进行盐析，盐析时，硫酸铵的添加量为：用硫酸铵调节所述洗脱液至饱和度为40%-50%；盐析后，在2-6℃，以7000-8000r/min 离心20-30min，得到沉淀；/n将所述沉淀用磷酸缓冲液溶解，所述沉淀与所述磷酸缓冲液的质量比为1:4-6；然后进行透析脱盐；/n脱盐后的酶液采用Q-Sepharose High Performance强离子交换色谱进行分离纯化，用磷酸缓冲液配置成的0-1mol/L的氯化钠进行梯度洗脱收集得到活性组分液；所述Q-Sepharose High Performance强离子交换色谱中的柱子的直径为2.6±0.2cm，长度为7±1cm；流速为1.8-2.2 mL/min；/n所述活性组分液经冷冻抽干即得t-PA成品；/n所述盐析的温度为2-6℃，时间为7-9h；/n所述透析脱盐采用透析袋进行，所述透析袋截留分子量为10000 Da；/n上述步骤中使用的磷酸盐缓冲液的浓度均为0.018-0.022 mol/L，pH均为7.3-7.5。/n
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