[发明专利]基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种花蕾种子纯度鉴定的方法

摘要

本发明公开了一种基于EST‑SSR标记的甜瓜品种“花蕾”杂交种种子纯度鉴定的方法。该方法以甜瓜品种花蕾H杂交种及其双亲的基因组DNA为模板，通过Gene Bank数据库上公布的甜瓜EST序列，利用Primer 3.0在线引物设计，设计EST‑SSR引物。经过筛选，得到1对杂交种带型为双亲的互补带型引物，经田间验证试验引物稳定性良好，且与田间试验结果较为吻合，能够对甜瓜杂交品种进行纯度鉴定。本发明的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。

主权项

1.一种基于EST‑SSR标记的甜瓜杂交种“花蕾2号”种子纯度鉴定的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）采用EST‑SSR特异性引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mix 5 μL，上游和下游引物10μmol/L各0. 5μL，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板，50 ng/μL，1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性2 min，32个扩增循环，94℃ 45 sec，55℃ 45 sec，72℃ 45 sec；72℃延伸7 min，4℃保存；所述的EST‑SSR特异性引物：上游引物序列：5’‑ CGGGACATAATTTGCTGAC ‑3’，下游引物序列： 5’‑ AGGGGTTAATAATTGTGTTGTG ‑3’；（2）对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40 % PAG 6 mL，TMED 30 μL，10% 过流酰胺 300 μL；设定电压 250 V，电泳 30 min，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；（3）通过分析EST‑SSR结果，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯度。