[发明专利]敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法在审

专利信息
申请号: 201610352736.4 申请日: 2016-05-24
公开(公告)号: CN106011049A 公开(公告)日: 2016-10-12
发明(设计)人: 贺建宁;杨峰;赵金山;柳楠;李和刚;巨安庆 申请(专利权)人: 青岛农业大学
主分类号: C12N5/071 分类号: C12N5/071
代理公司: 北京中济纬天专利代理有限公司 11429 代理人: 冯慧云
地址: 266109 山*** 国省代码: 山东;37
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摘要: 发明公开了一种敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法,属于生物技术领域,用40日龄的敖汉细毛羊皮肤作为实验材料,通过对皮肤进行体外培养,将分离出来的毛囊细胞进行生物学特性分析及鉴定,包括形态学观察、冻存、复苏及过程中细胞活力检测、生长动力学分析及生长曲线绘制、核型分析、波形蛋白免疫组化以及微生物污染检测等,以获得活性较高活力较强的细胞,进而建立敖汉细毛羊皮肤毛囊细胞细胞系。细胞活性更好,更利于后续的试验。降低了消化过程中胰蛋白酶的用量,同时缩短了消化时间。同时,细胞冻存保护液采用(80%FBS+20%DMSO):细胞原液=4:1,对细胞冻存保护效果在敖汉细毛羊成纤维细胞上效果更好。
搜索关键词: 细毛羊 毛囊 细胞系 建立 方法
【主权项】:
敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法,其特征是,包括以下步骤:(1)分离培养绵羊皮肤毛囊细胞①取40日龄出生羊采样部位清除羊毛,灭菌,切取含完整组织的皮肤样品,消毒,放入生理盐水中浸泡,然后用PBS清洗,迅速放入含有1%的青霉素‑链霉素的DMEM/F12培养液中,置于冰盒中,即为待分离培养组织样品;②将步骤(1)①得到的待分离培养组织样品消毒,清洗,后消化,然后放入含有DMEM/F12的培养皿中,取得毛囊置于离心管中,加入400μL 0.1%的胰蛋白酶消化15min,加入3倍体积的工作液终止消化,离心,吸去上清,打碎毛囊,过细胞筛,后接种,加入培养基中,培养,至细胞涨满90%时进行传代;所述工作液为20%FBS和1%的青霉素‑链霉素的DMEM/F12培养液;③传代培养:吸去培养液,清洗,加入0.1%的胰蛋白酶湿润细胞,然后加入0.1%的胰蛋白酶消化3~7min,当细胞质回缩,细胞边缘,间隙变大后,加入3ml DMEM终止反应,反复吹打皿底,然后按1:2传代到新的培养皿中,隔天换液,待细胞会合再次传代;(2)细胞冻存与复苏当细胞生长到对数生长期时,按照(1)③所述的传代培养步骤制成细胞悬液,离心、去上清,加入4℃预冷的培养液,然后转移到无菌冻存管中,封口,标记,然后用梯度冻存法置于4℃1h,‑20℃2h,‑80℃12h,然后转入液氮保存,复苏时用37℃温水快速晃动解冻按5*105个/ml接种到新培养皿。
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