[发明专利]一种香水百合的花药培养脱毒方法

摘要

本发明提供了一种香水百合的花药培养脱毒方法，该脱毒方法详细步骤包括：（1）配制香水百合花药诱导培养基；（2）接种花药的选材；（3）花药消毒与接种；（4）花药诱导培养；（5）胚性愈伤分化与继代培养；（6）香水百合鳞茎的炼苗与移栽；（7）香水百合单倍体植株的剔除。本发明的香水百合的花药培养脱毒方法通过香水百合花药培养获得了香水百合花粉植株，进而剔除群体中掺杂的单倍体植株获得香水百合二倍体植株，进一步进行百合病毒检测发现，该脱毒方法几乎达到100%脱毒，大大提高了百合种质，获得了产量和品质得到极大提升的百合脱毒植株。

主权项

一种香水百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：该花药培养脱毒方法的详细步骤如下：（1）配制香水百合花药诱导培养基香水百合花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：大量元素：KNO₃ 2500～2700mg/L，NH₄NO₃ 1600～1800mg/L，KH₂PO₄ 440～480mg/L，MgSO₄∙7H₂O 350～390mg/L，CaCl₂∙2H₂O 820～860mg/L；微量元素：MnSO₄∙4H₂O 20～25mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 8.0～9.0mg/L，H₃BO₃ 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO₄∙5H₂O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H₂O 0.02～0.03mg/L，NaMoO₄∙2H₂O 0.2～0.3mg/L；铁盐：Na₂‑EDTA∙2H₂O 35～40mg/L，FeSO₄∙7H₂O 25～30mg/L；有机成分：肌醇 90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，丝氨酸 0.75～0.85mg/L；激素：2，4‑D 3.2～3.6mg/L，KT 2.0～2.4mg/L；凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，水解蛋白 0.8～1.0g/L，活性炭 0.35～0.45g/L；碳源：蔗糖55～65g/L；将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60‑80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.8‑6.0，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；（2）接种花药的选材在香水百合正常现蕾开花季节，上午取材，用冰壶带回实验室；（3）花药消毒与接种将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2‑3滴吐温‑80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（1）的诱导培养基上；（4）花药诱导培养将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，50‑65d后诱导出花药胚性愈伤；（5）胚性愈伤分化与继代培养无菌条件下将诱导成功的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，光照条件下分化培养25‑40天至小芽长至0.6cm以上，将高于0.6cm的小芽切下，转接入继代培养基上继代培养，2‑3个月后即可得到直径 0.8‑2.0cm 的百合小鳞茎；（6）香水百合鳞茎的炼苗与移栽将香水百合小鳞茎的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将小鳞茎从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室内，定期喷施百合壮苗营养液来壮苗；（7）香水百合单倍体植株的剔除采用根尖压片法观察所得香水百合植株的倍性，剔除仅含12条染色体的百合单倍体植株。