[发明专利]一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β‑内酰胺酶的方法

摘要

本发明提供一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β‑内酰胺酶的方法，β‑内酰胺酶抗原40U/mL包被酶标板，0.8mg/ml的Rabbit Anti‑LACTB按体积比1:800稀释，包被，体积分数5％BSA封闭酶标板，加待测样品，设阴性对照，100ug/ml的β‑lactamase‑Antibody按体积比1:3000稀释，孵育；1mg/ml羊抗鼠lgG‑HRP体积比1:5000稀释加入，孵育；TMB单组份显色液显色；终止反应，测OD₄₅₀nm，通过待测样品平均OD值与阴性对照组OD值比判定样品中β‑内酰胺酶浓度阴性或阳性。该方法具有检测速度快、灵敏度高、操作简单等优点。

主权项

一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β‑内酰胺酶的方法，其步骤如下：1)包被β‑内酰胺酶抗原：β‑内酰胺酶抗原包被于酶标板上，每孔100μL，4℃过夜，次日洗板；2)包被多克隆抗体：将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti‑LACTB按Rabbit Anti‑LACTB:碳酸盐缓冲液体积比1:800的比例进行稀释，稀释后的溶液100μL/孔包被酶标板，4℃孵育过夜，次日洗板；3)封闭：用封闭液封闭酶标板，每孔200μL，37℃孵育2h，洗板；4)加样：加入待测样品，同时设阴性对照，每孔100μL，每份样品至少加双孔，37℃孵育1h，洗板；5)加单克隆抗体：浓度为100ug/ml的β‑lactamase‑Antibody按β‑lactamase‑Antibody:PBS缓冲液体积比1:3000的比例进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版,每孔100μL，37℃孵育1h，洗板；6)加酶标二抗：加入羊抗鼠lgG‑HRP，每孔100μL，37℃孵育1h，洗板；7)显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100μL，室温下避光显色约15min；8)终止反应:每孔加入终止液50μL终止反应，于终止反应后20min内测定实验结果；9)测定OD₄₅₀nm：用酶标仪测定450nm的OD值，当P/N≥2.1时，判定样品为阳性，当P/N＜2.1时，判定样品为阴性，其中P为待测样品平均OD值，N为阴性对照组OD值，P/N＝2.1时β‑内酰胺酶浓度为25U/ml，为本方法最低检测浓度；上述洗板为：弃去酶标板中剩余液体，用洗涤液250μL/孔洗涤酶标板，每孔洗涤3次，每次3‑5min，在滤纸上拍干。