[发明专利]一种萱草种质脱毒复壮方法

摘要

本发明提供了一种萱草种质脱毒复壮方法，该种质脱毒复壮方法详细步骤包括：（1）选材待接种萱草花蕾；（2）配制萱草花药诱导培养基；（3）花药消毒与接种；（4）花药诱导培养；（5）花药愈伤组织分化与生根培养；（6）萱草幼苗的炼苗与移栽；（7）非二倍体萱草植株的剔除。本发明的萱草种质脱毒复壮方法通过萱草花药培养途径获得了萱草花粉植株，进而剔除花培群体中的非二倍体萱草杂株获得萱草二倍体植株，该种质脱毒复壮方法脱毒效果显著，可以将萱草种质复壮，极大提高萱草的品质和产量。

主权项

1.一种萱草种质脱毒复壮方法，其特征在于：该种质脱毒复壮方法的详细步骤如下：（1）选材待接种萱草花蕾在萱草正常现蕾开花季节，选择大部分花药处于单核晚期的花蕾，用冰壶带回实验室，用湿润的纱布包裹后置于4℃冰箱中低温预处理3‑5d；（2）配制萱草花药诱导培养基萱草花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：大量元素：KNO3 2500～2700mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 440～480mg/L，MgSO4∙7H2O 350～390mg/L，CaCl2∙2H2O 820～860mg/L；微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl2∙6H2O 0.02～0.03mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L；铁盐：Na2‑EDTA∙2H2O 35～40mg/L，FeSO4∙7H2O 25～30mg/L；有机成分：肌醇90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸0.45～0.55mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，丝氨酸0.75～0.85mg/L，谷氨酞胺0.75～0.85mg/L；激素：2，4‑D 3.2～3.6mg/L，KT 2.0～2.4mg/L；凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，水解蛋白 0.8～1.0g/L，活性炭0.35～0.45g/L；碳源：蔗糖27～33g/L，麦芽糖13～17g/L；将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60‑80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.8‑6.0，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；（3）花药消毒与接种萱草花蕾低温预处理后，将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2‑3滴吐温‑80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（2）的萱草花药诱导培养基上；（4）花药诱导培养将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，45‑60d后诱导出萱草花药愈伤组织；（5）花药愈伤组织分化与生根培养无菌条件下将诱导成功的萱草花药愈伤组织转接到分化培养基上，光照条件下分化培养25‑40d，萱草分化出大量的绿芽，将高于1.5cm的小芽切下，转接入生根培养基上生根培养，35d后即观察到萱草绿苗发育出旺盛的根系；（6）萱草幼苗的炼苗与移栽将萱草幼苗的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将幼苗从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室内，遮荫一周后，常规大田栽培；（7）非二倍体萱草植株的剔除移栽后的萱草生长到现蕾期时，根据植株高度差异，将群体植株高度后20%和前20%的植株剔除；所述步骤（4）中花药诱导培养的培养条件控制为：温度24℃‑26℃，湿度65%‑80%，黑暗条件；所述步骤（5）中分化培养的培养基配方为：MS+1.0mg/L 6‑BA+0.1mg/L NAA+秋水仙素0.03mg/L+DMSO 0.3g/L；培养条件控制为：温度25℃‑27℃，湿度65%‑80%，光照为1600‑2000Lx，光周期为14h光/10h暗；所述步骤（5）中生根培养的培养基配方为：1/2MS+多效唑1.5mg/L；培养条件控制为：温度26℃‑28℃，湿度65%‑80%，光照为2500‑3000Lx，光周期为12h光/12h暗。