[发明专利]一种氯丙那林人工抗原的合成方法

摘要

一种氯丙那林人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以氯丙那林结构类似物为半抗原，用碳二亚胺法将其与载体蛋白BSA偶联，得氯丙那林人工抗原，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了氯丙那林的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原。

主权项

一种氯丙那林人工抗原的合成方法，其特征在于以氯丙那林结构类似物为半抗原，用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白BSA偶联，得到氯丙那林人工抗原；具体步骤如下：（1）半抗原4‑LR的合成：半抗原4‑LR合成路线为：称取15g化合物Ⅰ于100mL HCl中50℃反应过夜得化合物Ⅱ；化合物Ⅱ加入到100mL亚硫酰氯中80℃反应过夜得黄色油状液体即化合物Ⅲ；称取6.2g氰化亚铜、23g碘化钾溶于120 mL乙腈中震荡反应10min，将化合物Ⅲ加入到上述反应液中，室温反应过夜，乙腈洗涤吹干获得黑色固体即化合物Ⅳ；取化合物Ⅳ、5.5 g氢氧化铝LAH溶于300 mL四氢呋喃THF中，0℃冰水浴反应30 min，室温搅拌2h冰浴至0℃，反应体系中加入6mL水，6mL 质量浓度15%的氢氧化钠溶液，室温搅拌15min，浓缩得到黄色油状液体即化合物Ⅴ，化合物Ⅴ溶于70mL甲醇中并加入6.5g乙酰丙酸乙酯，50℃反应2h，加入4.2g NaBH₃CN冷却至0℃，加入丙烯酸乙酯冰浴条件下萃取，洗去有机相，离心，纯化，烘干的终产物即氯丙那林结构类似物Ⅵ，将氯丙那林结构类似物Ⅵ经盐酸酸化即得氯丙那林半抗原4‑LR；（2）人工抗原的合成：将步骤（1）制备所得氯丙那林半抗原4‑LR、碳二亚胺EDC、N‑羟基琥珀酰亚胺NHS以三者摩尔比依次为1︰3︰3的比例在pH5.6的酸性溶液中反应，室温搅拌反应8h，得到A液；称取BSA 112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L PBS缓冲液中，得到B液；在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得氯丙那林clo‑BSA偶联物混合液；（3）透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；（4）透析：将步骤（2）制备所得clo‑BSA偶联物混合液移入步骤（3）处理所得透析袋中，用2×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天后取出，即得氯丙那林人工抗原。